付寧寧 劉 佳 渠 成 王 然 許奕華 羅 晨 李峰奇

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所 北京 100097)

懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1的結(jié)構(gòu)及其結(jié)合寄主揮發(fā)物的預(yù)測分析*

付寧寧 劉 佳 渠 成 王 然 許奕華 羅 晨 李峰奇

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所 北京 100097)

【目的】 分析懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白編碼基因CcilCSP1的序列和表達(dá)特征，重點(diǎn)研究CcilCSP1結(jié)合二球懸鈴木寄主植物揮發(fā)物的能力，旨在為CcilCSP1的功能研究提供理論參考，為通過化學(xué)感受蛋白反向模擬篩選懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的信息素物質(zhì)提供依據(jù)?！痉椒ā?用分子克隆技術(shù)獲得懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1基因ORF的全長序列，用RT-qPCR研究該基因的表達(dá)模式，并通過生物信息學(xué)方法分析其序列特征。用Swiss-model構(gòu)建CcilCSP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并通過AutoDock 4.2開展CcilCSP1蛋白與寄主植物9種揮發(fā)物成份的分子對接，用Amber 14對其中結(jié)合最為穩(wěn)定的反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白的復(fù)合物開展了10 000 ps的分子動力學(xué)模擬，并進(jìn)一步通過“Y”型嗅覺儀測定反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的行為學(xué)影響?！窘Y(jié)果】 成功克隆到該蟲的化學(xué)感受蛋白基因CcilCSP1，且該基因在成蟲中顯著高表達(dá)。序列分析表明，CcilCSP1具有CSPs家族的典型特征，該基因與綠盲蝽的AlucCSP1，AlucCSP3，AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1親緣關(guān)系較近。同源建模和分子對接發(fā)現(xiàn)，在二球懸鈴木9種植物揮發(fā)物中反式-β-石竹烯與CcilCSP1的結(jié)合能力最強(qiáng)(kl=2.63 μm, Binding Energy=-7.61)，通過分析二者的結(jié)合特性，推測TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是CcilCSP1蛋白結(jié)合反式-β-石竹烯所需的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示，CcilCSP1蛋白能夠與反式-β-石竹烯穩(wěn)定結(jié)合。進(jìn)一步的行為學(xué)試驗(yàn)表明，0.1 μg的反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲有顯著的驅(qū)避作用?！窘Y(jié)論】 本研究克隆到在成蟲中顯著高表達(dá)的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白基因CcilCSP1。用分子對接和分子動力學(xué)模擬方法發(fā)現(xiàn)CcilCSP1能與二球懸鈴木寄主揮發(fā)物成份反式-β-石竹烯穩(wěn)定結(jié)合，并通過進(jìn)一步的行為學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。該研究可為懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1的功能研究奠定基礎(chǔ)，也為基于計(jì)算機(jī)反向篩選獲得懸鈴木方翅網(wǎng)蝽信息素物質(zhì)研發(fā)提供依據(jù)。

懸鈴木方翅網(wǎng)蝽； 化學(xué)感受蛋白； 寄主植物揮發(fā)物； 分子對接； 分子動力學(xué)模擬

懸鈴木(Platanusspp.)在我國是引進(jìn)栽培種，包括一球懸鈴木(P.occidentalis)、二球懸鈴木(P.acerifolia)和三球懸鈴木(P.orientalis)3個種。我國廣泛栽培的是二球懸鈴木，其具有樹勢優(yōu)美、繁殖生長快、抗逆性強(qiáng)、降噪和抗污染等優(yōu)點(diǎn)，享有“行道樹之王”的美譽(yù)。懸鈴木方翅網(wǎng)蝽(Corythuchaciliata)屬于半翅目(Hemiptera)網(wǎng)蝽科(Tingidae)方翅網(wǎng)蝽屬(Corythucha)，原產(chǎn)于美國中東部地區(qū)(Halbertetal., 1983)，在20世紀(jì)60年代入侵到意大利，隨后相繼傳入歐洲、南美洲、亞洲和非洲等地(Maceljski, 1986; Pickeretal., 2015; Prado, 1990; Chungetal., 1996)，并造成了嚴(yán)重危害。2002年我國長沙首次發(fā)現(xiàn)懸鈴木方翅網(wǎng)蝽危害(Streito, 2006; 鞠瑞亭等, 2010)， 2006年該蟲在武漢普遍發(fā)生(王福蓮等, 2008)。目前懸鈴木方翅網(wǎng)蝽在我國入侵?jǐn)U散范圍較廣，已入侵到湖南、湖北、上海、山東、河南和北京等地 (鞠瑞亭等, 2010; 王福蓮等, 2008; 虞國躍等, 2014)，在我國多地呈暴發(fā)態(tài)勢。

寄主植物在受到昆蟲危害后，會釋放出一系列的揮發(fā)性化合物，這些揮發(fā)物對植食性昆蟲行為有著重要的調(diào)控作用。它一方面可影響昆蟲的寄主選擇，另一方面也可在被昆蟲危害后大量釋放，趨避昆蟲或吸引天敵，形成寄主防御(Dickeetal., 1990; Turlingsetal., 1990)。從寄主植物揮發(fā)物中可以篩選到對昆蟲具有顯著引誘或驅(qū)避活性的揮發(fā)物，用于進(jìn)一步研發(fā)昆蟲行為調(diào)節(jié)劑。昆蟲化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是一種小分子蛋白，成熟的蛋白約有 120個氨基酸組成，含有4個保守的半胱氨酸位點(diǎn)?；瘜W(xué)感受蛋白與昆蟲的取食、交配、產(chǎn)卵點(diǎn)的選擇和自身防御等有著密切的關(guān)系(Fieldetal., 2000; Kaissling, 2001; Ozakietal., 2008; Pelosietal., 2005; Steinbrecht, 1998; 滑金鋒等, 2012)。在本研究中，筆者從懸鈴木方翅網(wǎng)蝽中克隆到一個化學(xué)感受蛋白基因CcilCSP1，對其開展序列分析和表達(dá)模式研究，模擬該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，將其與9種二球懸鈴木植物揮發(fā)物成分進(jìn)行了分子對接和分子動力學(xué)研究，篩選與CcilCSP1具有穩(wěn)定強(qiáng)結(jié)合作用的化合物，并通過昆蟲行為學(xué)來驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，為懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1的功能研究提供基礎(chǔ)，為計(jì)算機(jī)反向篩選獲得懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的行為調(diào)節(jié)劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物環(huán)境保護(hù)保護(hù)研究所院內(nèi)二球懸鈴木葉片上，在北京市農(nóng)林科學(xué)院建立種群，用懸鈴木葉片進(jìn)行飼養(yǎng)，繁衍2代后用于試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1CcilCSP1基因的克隆與序列研究 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽RNA的提取與cDNA的合成參考筆者實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行(Lietal., 2016)。CcilCSP1的克隆采用基因特異性引物，上下游引物分別為： 5′-ATGAAAGTTTTCGCGATTCTCG-3′，5′- TTAAATTTTAATTCCTCTTTTCTCAGCTT-3′。以懸鈴木方翅網(wǎng)蝽cDNA為模板，利用PrimeSTAR HS DNA polymerase(TakaRa)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為50 μL： 10 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，10μmol·L-1上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，dd H2O 31.5 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性1 min，隨后進(jìn)行98 ℃，10 s、58 ℃，15 s、72 ℃，1 min共30個熱循環(huán)，然后進(jìn)行72 ℃ 10 min的最后延伸。PCR產(chǎn)物由EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒(Trans Gen)進(jìn)行回收，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后按照pEASY-Blunt Cloning Kit試劑盒說明克隆于pEASY-Blunt Cloning Vector載體上，重組載體轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，然后涂在 LB 平板(含Ampicillin /X-gal/IPTG)上，37 ℃ 過夜培養(yǎng)。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取白色單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定后，選取3個獨(dú)立的克隆送至北京三博遠(yuǎn)志生物公司測序。

用生物信息學(xué)軟件對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白測序結(jié)果進(jìn)行分析，序列分析通過 DNAMAN完成，通過BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行同源序列查找，基因結(jié)構(gòu)由ORF Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進(jìn)行預(yù)測。利用MEGA 6.0對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1與其他37個昆蟲CSP蛋白序列進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹，Boot strip值設(shè)為1 000，cut-off value設(shè)為50%，其他昆蟲的CSP分別為： 綠盲蝽(Apolyguslucorum) (AlucCSP1: AGD80081.1; AlucCSP2: AEP95756.1; AlucCSP3: AEP95757.1; AlucCSP4: AEP95758.1; AlucCSP5: AGD80085.1; AlucCSP6: AGD80086.1; AlucCSP7: AGD80087.1; AlucCSP8: AGD80088.1)，苜蓿盲蝽(Adelphocorislineolatus) (AlinCSP1: ACZ58019.1; AlinCSP2: ACZ58021.1; AlinCSP3: ACZ58020.1; AlinCSP4: ACZ58022.1; AlinCSP5: ACZ58023.1; AlinCSP6: ACZ58024.1; AlinCSP7: ACZ58025.1; AlinCSP8: ACZ58026.1)，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)(ApisCSP1: ACYPI000094; ApisCSP2: ACYPI000096; ApisCSP3: ACYPI000095; ApisCSP4: ACYPI000097; ApisCSP5: ACYPI000093; ApisCSP6: ACYPI009116; ApisCSP7: ACYPI005842; ApisCSP8: ACYPI000345; ApisCSP9: ACYPI003368; ApisCSP10: ACYPI002311; ApisCSP11: ACYPI39275; ApisCSP13: ACYPI53869)，腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae) (TputCSP1: KP776981; TputCSP2: KP776982)，肩突硬蜱(ixodesscapularis) (IscaCSP1: DQ855478)。蛋白性質(zhì)分析采用ExPASy服務(wù)器(http:∥web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析，信號肽預(yù)測由 SignalP V4.1 程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/serbices/SignalP/)完成。

利用RT-qPCR檢測CcilCSP1在雌成蟲、雄成蟲及幼蟲中的表達(dá)量。熒光定量PCR所需特異性引物由IDT (https:∥www.idtdna.com/pages/support/international/)進(jìn)行設(shè)計(jì)，CcilCSP1的正反向引物分別為： 5′-GCAAGAAGTGCACTGAGAAAC-3； 5′-TTGGCCAGTTCATCG-TAGTC-3′，內(nèi)參基因選擇β-actin (KX108734)基因，其上下游引物為： 5′-GGGTATGGAATCTTGCGGTATC-3′； 5′-TGTTGG CGTACAGGTC-TTTC-3′。熒光定量PCR在ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行，每20 μL的RT-qPCR反應(yīng)體系含有GoTaq Probe qPCR Master Mix (2×) 10 μL, 正、反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddH2O 4 μL。PCR程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性2 min，隨后 95 ℃，15 s、60 ℃，1 min共40個熱循環(huán)，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后采集CT值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(王思豹等, 2015)。樣品間的差異比較采用SPSS單因素方差分析SNK檢驗(yàn)。

1.2.2 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1的同源建模及模型評價 通過Blast在Protein Date Back中搜索與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1序列一致性最佳 (同源性大于30%)的蛋白序列作為建模的模板(Quetal., 2015)，通過Swiss-model (Peitsch, 1996) (http:∥swiss-model.expasy.org/)，對去掉信號肽的CcilCSP1進(jìn)行同源建模，獲得該蛋白的三維結(jié)構(gòu)。用Procheck、Verify_3D、ERRAT方法(http:∥nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES_4/) (Laskowskietal., 1993)對模型的主鏈鍵長、鍵角的合理性，三維結(jié)構(gòu)與一級結(jié)構(gòu)的關(guān)系及不同原子間非鍵相互作用等特性進(jìn)行評價。用PROSA(Wiederstein and Sippl, 2007)(http:∥prosa.services.came.sbg.ac.at/)來判斷CcilCSP1蛋白模型的質(zhì)量。

1.2.3 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1蛋白的分子對接 選擇筆者實(shí)驗(yàn)室前期鑒定到的二球懸鈴木9種植物揮發(fā)物成份，用于CcilCSP1的分子對接研究，用Chemoffice 2010模擬這9種植物揮發(fā)物的三維結(jié)構(gòu)。用Autodock4.2(Morrisetal., 2009)編輯化合物及CcilCSP1的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)定網(wǎng)格參數(shù)為40點(diǎn)×40點(diǎn)×40點(diǎn)，格點(diǎn)間距為0.037 5 nm，格點(diǎn)盒子中心位于CcilCSP1蛋白活性位點(diǎn)中心，用Lamarckian遺傳算法(LGA)進(jìn)行對接，設(shè)置遺傳算法參數(shù)maximum number of energy evaluations為2 500 000(莊緒靜等, 2013)，對接計(jì)算通過Autodock4.2進(jìn)行，用PyMOL顯示對接結(jié)果。

1.2.4 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1與反式-β-石竹烯的分子動力學(xué)模擬 為了檢測對接結(jié)果的可靠性，筆者選用CcilCSP1與反式-β-石竹烯對接的復(fù)合物進(jìn)行分子動力學(xué)(MD)模擬。用AMBER14(Caseetal., 2005)軟件中的Xleap模塊對對接復(fù)合物進(jìn)行初始化處理，包括加氫、加電荷、加水等處理以生成拓?fù)湮募驮幼鴺?biāo)文件，用Sander模塊進(jìn)行對接復(fù)合物的優(yōu)化和10 000 ps的分子動力學(xué)模擬，MD模擬的質(zhì)量由主鏈原子的均方根位移(RMSD)評價(扈國棟, 等. 2009)。

1.2.5 反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的行為學(xué)研究 用“Y”型嗅覺儀來判斷0.1 μg反式-β-石竹烯對雌、雄懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲行為的影響?！癥”型嗅覺儀的兩臂及直管長度均為10 cm，直徑為1.5 cm，氣流為250 mL·min-1。采用初羽化的成蟲進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中，每次接入1頭成蟲，觀察10 min內(nèi)該蟲對反式-β-石竹烯的行為反應(yīng)，并記錄結(jié)果，10頭蟲后，將“Y”型嗅覺儀左右顛倒，以消除試驗(yàn)環(huán)境的影響。反式-β-石竹烯標(biāo)準(zhǔn)品購買自Sigma-Aldrich公司,使用液體石蠟將其稀釋至終濃度為0.01 μg·μL-1。用移液器每次取10 μL樣品加到濾紙塊上，以液體石蠟做對照，放在“Y”型嗅覺儀兩端，進(jìn)行行為反應(yīng)測試，試驗(yàn)重復(fù)6次，每次10頭昆蟲。測試結(jié)果由卡方檢驗(yàn)進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)分析采用IBM SPSS Statistics 22。

2 結(jié)果與分析

2.1懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1的基因克隆和序列分析

通過分子克隆技術(shù)，克隆到懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的CcilCSP1全長基因。其開放閱讀框?yàn)?93 bp，編碼130個氨基酸，其基因序列已提交到GeneBank(編號： KY354042)。與其他半翅目昆蟲的化學(xué)感受蛋白氨基酸序列比對顯示，CcilCSP1具有CSPs家族的典型特征，含有4個保守的半胱氨酸位點(diǎn)(圖1)。通過CcilCSP1和其他37個昆蟲化學(xué)感受蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖2)，CcilCSP1與綠盲蝽的AlucCSP1，AlucCSP3，AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1具有較近的親緣關(guān)系。此外，Nr注釋結(jié)果顯示，CcilCSP1與AlucCSP1同源性為55%(E-value為1E-41)、與AlucCSP3同源性為52%(E-value為3E-31)、與AlucCSP8同源性為52%(E-value為3E-29)，與AlinCSP1的同源性為55%(E-value 為2E-41)，綜合以上序列分析結(jié)果，暫將其命名為CcilCSP1。

圖1 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1與其他昆蟲CSP的序列比對Fig.1 Alignment of deduced amino acid sequence of CcilCSP1 with CSPs from other insect species“C”表示保守的半胱氨酸序列，其他昆蟲化學(xué)感受蛋白的GenBank登錄號如下。綠盲蝽(Apolygus lucorum)AlucCSP1：AGD80081.1；AlucCSP2：AGD80082.1； AlucCSP3：AGD80083.1；AlucCSP8：AGD80088.1；苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)AlinCSP1：ACZ58019.1；AlinCSP2：ACZ58021.1；AlinCSP3：ACZ58020.1。 “C” represents conserved cysteines. The GenBank of the other chemosensory proteins is as below. Apolygus lucorum AlucCSP1: AGD80081.1; AlucCSP2: AGD80082.1; AlucCSP3: AGD80083.1; AlucCSP8: AGD80088.1; Adelphocoris lineolatus AlinCSP1: ACZ58019.1; AlinCSP2: ACZ58021.1; AlinCSP3: ACZ58020.1.

圖2 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1與其他昆蟲CSP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CcilCSP1 and CSPs from other insects虛線表示本研究的化學(xué)感受蛋白CcilCSP1及與其具有較近親緣關(guān)系的其他化學(xué)感受蛋白。The dottedline indicate the chemosensory protein CcilCSP1 and other ones that hovea close relationship with this study. Aluc： 綠盲蝽(Apolygus lucorum)； Alin： 苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)； Apis： 豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)； Amel： 意大利蜜蜂(Apis mellifera)； Tupt： 腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)； Isca： 肩突硬蜱(Ixodes scapularis)。使用MEGA 6.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrip值設(shè)為1 000。The NJ phylogenetic tree was constructed using MEGA60,and the Bootstrip value was set to 1 000.

2.2懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1基因的表達(dá)模式分析

用RT-qPCR技術(shù)對CcilCSP1基因在懸鈴木方翅網(wǎng)蝽雌成蟲、雄成蟲及幼蟲中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：CcilCSP1基因在雌雄成蟲中的表達(dá)量極顯著高于在幼蟲中的表達(dá)量(雌成蟲/幼蟲Plt; 0.01，雄成蟲/幼蟲Plt; 0.01)，CcilCSP1在雄成蟲的表達(dá)量顯著高于雌成蟲(P=0.015) (圖3)。

圖3 RT-qPCR鑒定CcilCSP1的表達(dá)模式Fig.3 Relative expression levels of CcilCSP1 measured by real-time quantitative PCR

2.3CcilCSP1同源建模的模型分析

在PDB庫中對CcilCSP1序列進(jìn)行同源性搜索，找到4種已知結(jié)構(gòu)的昆蟲CSP蛋白，得分從高到低分別為MbraCSPA6、MbraCSP2、BmorCSP1、SgreCSP4，在這些序列中選擇得分最高的MbraCSPA6(score=79.0，同源性為45%)作為同源建模的模板進(jìn)行模型構(gòu)建。通過Procheck評估結(jié)果的Ramachandran圖(圖4)，可以看出模建蛋白94.7%的殘基落在最佳區(qū)域(紅色A、B、L區(qū)域)，5.3%的殘基落在其他較合適區(qū)(亮黃色a、b、l、p區(qū)域)，沒有殘基落在勉強(qiáng)許可區(qū)和不合理區(qū)已達(dá)到高質(zhì)量建模標(biāo)準(zhǔn)(gt;90%)。此外， G-factor的各值(表1)均大于-0.5，說明模型蛋白共價鍵及鍵角構(gòu)象是合理的。用Verify_3D對模建蛋白的三維結(jié)構(gòu)與一級結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行評價發(fā)現(xiàn)， CcilCSP1蛋白所有殘基(100%)三維結(jié)構(gòu)模型與一級結(jié)構(gòu)的平均得分均大于0.2(表1)，表明模建蛋白的所有殘基都是合理的。 用ERRAT法對模建蛋白評價得分為95.789，表明模建蛋白不同原子間的非鍵相互作用是合理的。用PROSA評價得到的Z-score打分為-6.26，落在了較好結(jié)構(gòu)蛋白的Z-score分布范圍。以上各評價參數(shù)結(jié)果表明，同源建模得到的蛋白模型是優(yōu)質(zhì)合理的。

圖4 CcilCSP1三維結(jié)構(gòu)拉氏構(gòu)象圖Fig.4 The Ramachandran plot of CcilCSP1圖中紅色A,B,L區(qū)域?yàn)榈鞍讱埢淖罴褏^(qū)域，亮黃色a,b,l,p區(qū)域?yàn)榈鞍讱埢妮^合適區(qū)域，土黃色～a、 ～b、 ～l、～p區(qū)域?yàn)榈鞍讱埢拿銖?qiáng)許可區(qū)和不合理區(qū)。In the figure, the red A, B, and L regions are the best regions of the protein residues; The bright yellow a, b, l, p regions are the appropriate regions of the protein residues; The soil yellow ～a, ～b, ～l, ～p regions are the barely permitted and irrational area for protein residues.

G因子G?factors二面石Dihedrals共價鍵Covalent綜合Overall三維評估Verify＿3D誤差函數(shù)ERRATZ值Z?score017041026100%95789-626

2.4CcilCSP1與二球懸鈴木寄主揮發(fā)物的分子對接

用Autodock 4.2計(jì)算CcilCSP1與9種二球懸鈴木寄主植物揮發(fā)物成份的結(jié)合能量及抑制常數(shù)(表2)，CcilCSP1與這些揮發(fā)物的結(jié)合能量由低到高為： 反式-β-石竹烯、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、1,8-桉葉素、α-側(cè)柏烯、檜烯、γ-松油烯、月桂烯、順-3-己烯醇乙酸酯、順-3-己烯醇。反式-β-石竹烯與CcilCSP1有較低的抑制常數(shù)(kllt; 10)和結(jié)合能量，分別為2.63 μm和34.09 kJ·mol-1，認(rèn)為該揮發(fā)物可通過分子間作用力與CcilCSP1蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CcilCSP1與反式-β-石竹烯之間主要是通過范德華力和疏水作用相互作用的(圖5)，在CcilCSP1蛋白結(jié)合活性區(qū)域，與反式-β-石竹烯分子距離小于4?的殘基有： THR-63、LEU-64、ASN-67、ASP-60、TYR-29、ILE-32、LEU-86、ASP-30、GLN-83(圖6)。其中TYR-29與植物揮發(fā)物反式-β-石竹烯的范德華力最大，而GLN-83、LEU-64、ASP-30在反式-β-石竹烯周圍形成氫鍵結(jié)構(gòu)將其包裹在其中。TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是反式-β-石竹烯與CcilCSP1結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

表2 9種寄主植物揮發(fā)物與CcilCSP1分子對接結(jié)果Tab.2 Binding affinities of nine host-plantvolatiles to CcilCSP1

圖5 反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白活性結(jié)構(gòu)域的結(jié)合Fig.5 Trans-β-caryophyllene docked into the active-site of CcilCSP1 protein

圖6 反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白結(jié)合關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)及相互作用Fig.6 Diagram of the key amino acid sites and interaction of trans-β-caryophyllene with CcilCSP1 protein

2.5CcilCSP1與反式-β-石竹烯復(fù)合物的分子動力學(xué)研究

為了驗(yàn)證分子對接結(jié)果，進(jìn)一步通過10 000 ps分子動力學(xué)研究，計(jì)算了CcilCSP1與反式-β-石竹烯復(fù)合物的主鏈原子RMSD值，RMSD值是指在分子動力學(xué)模擬過程中，復(fù)合物體系主鏈碳原子的均方根偏差，其變化是用來衡量復(fù)合物體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù)之一。從懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1蛋白與反式-β-石竹烯復(fù)合物的RMSD值變化曲線(圖7)可以看出，前50 ps為升溫過程，體系從0 K加熱到300 K，RMSD變化很大。接下來50 ps是動力學(xué)平衡過程，復(fù)合物內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，RMSD值上升至2.5?。最后10 000 ps是穩(wěn)定過程，復(fù)合物的RMSD值基本趨于平衡，RMSD值為3.0?，振幅僅為0.3?，證明懸鈴木方翅網(wǎng)蝽CcilCSP1蛋白與反式-β-石竹烯能夠穩(wěn)定結(jié)合。

圖7 MD過程中復(fù)合物主鏈碳原子均方根偏差(RMSD)Fig.7 Root-Mean-Square Deviation(RMSD) of backbone atoms in MD simulation

2.6反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的行為學(xué)影響

結(jié)合分子對接和分子動力學(xué)的結(jié)果表明，反式-β-石竹烯能與CcilCSP1活性部位結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。結(jié)合RT-qPCR結(jié)果，推測反式-β-石竹烯可能影響懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的行為反應(yīng)。為證實(shí)上述研究結(jié)果，進(jìn)一步用“Y”型嗅覺儀檢測了反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的行為影響，經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖9)，反式-β-石竹烯對雌成蟲和雄成蟲均有顯著的驅(qū)避作用(雌成蟲：χ2=6.4，Plt; 0.05； 雄成蟲：χ2=5.488，Plt; 0.05)。

圖8 反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲行為的影響Fig.8 Responses of C. ciliata to trans-β-caryophyllene

3 討論

筆者報道了懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白編碼基因CcilCSP1，序列分析表明，CcilCSP1與綠盲蝽的AlucCSP1、AlucCSP3、AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1具有較近的親緣關(guān)系，推測它們具有相似的功能。前人的研究發(fā)現(xiàn)，AlinCSP1和AlucCSP1對寄主植物揮發(fā)物具有較高的結(jié)合能力(滑金鋒等, 2012)。其中，苜蓿盲蝽AlinCSP1能夠結(jié)合植物活性物質(zhì)(Z)-3-hexen-1-ol, (E)-2-hexen-1-al和valeraldehyde (Guetal., 2012)。在本研究中通過分子對接和動力學(xué)研究，表明CcilCSP1其能夠結(jié)合二球懸鈴木寄主植物揮發(fā)物成分，該結(jié)果與其同源基因在苜蓿盲蝽和綠盲蝽中的報道相一致(Guetal., 2012； 滑金鋒等, 2012)。CcilCSP1的表達(dá)模式研究表明，CcilCSP1在雌雄成蟲中顯著高表達(dá)，這與后續(xù)的行為學(xué)結(jié)果相一致。此外，CcilCSP1基因在雄蟲中的表達(dá)量顯著高于雌蟲中的表達(dá)量，這可能是因?yàn)镃cilCSP1的功能具有多樣性，可能參與了對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽性信息素物質(zhì)的結(jié)合，由于懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的性信息素成份尚未報道，在未來對CcilCSP1的功能尚需進(jìn)一步的深入研究。

通過分子對接和分子動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CcilCSP1與寄主揮發(fā)物反式-β-石竹烯的結(jié)合能力最強(qiáng)。反式-β-石竹烯是一種常見的植物揮發(fā)物，能夠影響多種昆蟲的行為。通過“Y”型嗅覺儀研究發(fā)現(xiàn)，反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲具有顯著地驅(qū)避效果，前期研究發(fā)現(xiàn)反式-β-石竹烯對煙粉虱(趙艷群等， 2012)和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda) (Smithetal., 2012)等均有顯著驅(qū)避作用，與本研究結(jié)果相類似。此外，本研究發(fā)現(xiàn)TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，該結(jié)果還需要進(jìn)一步通過定點(diǎn)突變技術(shù)和嗅覺蛋白熒光結(jié)合試驗(yàn)來驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究克隆到懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的化學(xué)感受蛋白基因CcilCSP1，該基因具有化學(xué)感受蛋白的典型特征并在成蟲中顯著高表達(dá)。通過分子對接和分子動力學(xué)方研究，發(fā)現(xiàn)CcilCSP1能與二球懸鈴木寄主植物成份反式-β-石竹烯穩(wěn)定結(jié)合，行為學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反式-β-石竹烯能顯著驅(qū)避懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲。該研究為今后的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學(xué)感受蛋白CcilCSP1的功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為通過計(jì)算機(jī)發(fā)現(xiàn)篩選懸鈴木方翅網(wǎng)蝽信息素物質(zhì)提供了依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

AnalysisofCorythuchaciliataCcilCSP1StructureandPredictionofItsBindingtoHost-PlantVolatiles

Fu Ningning Liu Jia Qu Cheng Wang Ran Xu Yihua Luo Chen Li Fengqi

(InstituteofPlantandEnvironmentProtection,BeijingAcademyAgricultureandForestrySciencesBeijing100097)

【Objective】Corythuchaciliata(Say) is an important invasive forest pest, and seriously damagesPlatanusspp. This paper analyzes the sequence and expression characteristics of chemosensory proteins 1 (CcilCSP1), focus on the ability of CcilCSP1 binding to host volatiles ofP.acerifolia. This study gims to provide a foundation for studying function of the chemosensory protein and a useful reference for searching the pheromone substance.【Method】 The full-length ORF sequence of CcilCSP1 was obtained by the molecular cloning technique. The expression pattern of CciCSP1 was analyzed by RT-qPCR. The three-dimensional structure of chemosensory protein CcilCSP1 was mimicked, and nine plant volatiles were docked to the CcilCSP1 by AutoDock 4.2. The molecular dynamics simulation analysis was carried out to the docking complex oftrans-β-caryophyllene and CcilCSP1. The effects oftrans-β-caryophyllene on theC.ciliatawere assayed by Y-tube olfactometer.【Result】 The CcilCSP1 gene ofC.ciliatawas cloned and sequenced, and it was highly expressed in adults. The sequence analyses showed that CcilCSP1 had the typical characteristics of CSPs, and closely related with AlucCSP1, AlucCSP3, AlucCSP8 and AlinCSP1. The binding capacity oftrans-β-caryophyllene to CcilCSP1 was strongest (kl=2.63 μm, Binding Energy=-7.61) in nine volatiles. It is suggested that TYR-29, GLN-83, LEU-64 and ASP-30 may be ligand-binding active sites. Molecular dynamics simulations showed that CcilCSP1 protein could bind totrans-β-caryophyllene stably. Furthermore, behavioral experiments showed that 0.1 μgtrans-β-caryophyllene had a significant evading effect on the adults ofC.ciliata.【Conclusion】CcilCSP1, a chemosensory protein gene highly expressed inC.ciliataadults, was cloned and sequenced in this study. Molecular docking and molecular dynamics simulations were used to investigate the interaction between CcilCSP1 andtrans-β-caryophyllene, which was confirmed by the behavioral experiment. This study lays a foundation for the functional study of the protein CcilCSP1 ofC.ciliata, and provid a useful reference for searching for the pheromone substance.

Corythuchaciliata； chemosensory proteins(CSPs)； homology modeling； host-plant volatiles； molecular docking； dynamics simulation

10.11707/j.1001-7488.20171012

2016-10-12；

2017-02-05。

北京市科技計(jì)劃課題(Z151100001115002); 北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20170709)。

*李峰奇為通訊作者。

S718.7

A

1001-7488(2017)10-0109-09