江萬航 衛(wèi)安娜 龐慧敏 譚守勇

·論著

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在疑似肺結(jié)核
早期診斷中的臨床意義

江萬航 衛(wèi)安娜 龐慧敏 譚守勇

目的探討實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)用于疑似肺結(jié)核早期診斷的臨床意義。方法分析2015年7—12月廣州市胸科醫(yī)院收治的呼吸道疾病患者338例，其中疑似肺結(jié)核患者242例(疑似肺結(jié)核組)，臨床已排除肺結(jié)核的肺部其他疾病患者96例(對(duì)照組)。所有患者同時(shí)進(jìn)行了痰SAT檢測(cè)、抗酸桿菌涂片、分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查；統(tǒng)計(jì)疑似肺結(jié)核患者菌種鑒定結(jié)果，對(duì)SAT檢測(cè)與結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果的符合率、SAT檢測(cè)診斷疑似肺結(jié)核的敏感度和特異度進(jìn)行分析。結(jié)果疑似肺結(jié)核組242例患者中痰培養(yǎng)陽性233例，菌種鑒定為MTB感染者222例，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染者11例；痰培養(yǎng)結(jié)果為陰性的患者9例。對(duì)照組患者痰培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。菌種鑒定為MTB感染者SAT檢測(cè)陽性192例，SAT檢測(cè)與菌種鑒定符合率為86.5%(192/222)；菌種鑒定為NTM感染者SAT檢測(cè)陽性0例(0/11)，與菌種鑒定符合率為100.0%(11/11)；對(duì)照組SAT檢測(cè)陽性者2例(2.1%，2/96)，與分枝桿菌培養(yǎng)符合率為97.9%(94/96)。SAT在疑似肺結(jié)核患者診斷中的敏感度為86.5%(192/222)，特異度為97.9%(94/96)。結(jié)論在疑似肺結(jié)核患者中開展SAT檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核早期診斷具有重要臨床意義。

結(jié)核，肺； 核酸擴(kuò)增技術(shù)； 早期診斷； 分枝桿菌感染, 非典型性； 呼吸道疾病

早期、及時(shí)、準(zhǔn)確診斷是肺結(jié)核診治的關(guān)鍵，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)進(jìn)入了結(jié)核病診斷領(lǐng)域，其具有檢測(cè)時(shí)間短，敏感度、特異度高的特點(diǎn)，逐漸引起臨床重視。有文獻(xiàn)報(bào)道，SAT檢測(cè)不僅可快速檢測(cè)痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌(MTB)，而且可判斷待檢痰液中MTB是否為活菌[1]，2～3 h即可獲得檢測(cè)結(jié)果[2]，在耗時(shí)和檢測(cè)成本上均低于Xpert MTB/RIF法[3]，且試驗(yàn)要求較熒光PCR擴(kuò)增法低[4]，可快速、準(zhǔn)確地對(duì)肺結(jié)核做出早期診斷[5]。

本研究回顧性分析2015年7—12月廣州市胸科醫(yī)院收治的痰抗酸桿菌涂片連續(xù)3次陽性的疑似肺結(jié)核患者242例，同時(shí)納入臨床已排除肺結(jié)核的肺部其他疾病患者96例，進(jìn)行了痰SAT檢測(cè)、分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查，探討在疑似肺結(jié)核患者中開展SAT檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核早期診斷的臨床意義。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

1.疑似肺結(jié)核組：對(duì)2015年7—12月在廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核科住院的所有呼吸系統(tǒng)疾病患者進(jìn)行篩查，符合下列條件的患者進(jìn)入本研究：痰抗酸桿菌涂片連續(xù)3次陽性，同時(shí)完成痰SAT檢測(cè)、分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查；剔除檢查資料不完整的患者。入組疑似肺結(jié)核患者242例，其中男158例，女84例；年齡18～70歲，平均(47.5±11.6)歲。肺結(jié)核的臨床診斷依據(jù)文獻(xiàn)[6]。

2.對(duì)照組：收集同期廣州市胸科醫(yī)院收治的臨床已排除肺結(jié)核的肺部其他疾病患者96例，其中男55例，女41例，年齡28～68歲，平均(43.3±10.1)歲；包括慢性阻塞性肺疾病58例(60.4%)，肺炎17例(17.7%)，肺癌5例(5.2%)，支氣管擴(kuò)張9例(9.4%)，肺曲霉菌病5例(5.2%)，塵肺2例(2.1%)。上述患者的診斷均依據(jù)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。

本研究所有患者HIV檢查均為陰性。本研究通過廣州市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

二、研究方法

標(biāo)本涂片根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9]處理，經(jīng)金胺“O”-羅丹明熒光染色檢測(cè)分枝桿菌，應(yīng)用BACTEC MGIT 960 和專用培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)，采用常規(guī)生化鑒定法和基因芯片法進(jìn)行菌種鑒定。SAT檢測(cè)試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供。

痰標(biāo)本留?。喝朐汉蟮诙欤颊哂谇宄渴诤?，同時(shí)留取1次痰SAT檢測(cè)標(biāo)本、3次痰抗酸桿菌涂片標(biāo)本、1次痰分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本，對(duì)于培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)一步行菌種鑒定，陽性報(bào)告結(jié)果為MTB生長(zhǎng)或非結(jié)核分枝桿菌(NTM)生長(zhǎng)。痰涂片及培養(yǎng)操作按《現(xiàn)代結(jié)核病診斷技術(shù)》[10]進(jìn)行。

菌種鑒定的方法和試劑：對(duì)培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢，做MPB64分泌蛋白抗原檢測(cè)，檢測(cè)陽性標(biāo)本加做對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)，確認(rèn)是否為MTB。MPB64分泌蛋白抗原檢測(cè)陰性培養(yǎng)物進(jìn)行晶芯@基因芯片分枝桿菌菌種鑒定[11]。MPB64分泌蛋白抗原檢測(cè)試劑盒由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司提供，晶芯@基因芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2007表收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%。

結(jié) 果

一、分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果

242例疑似肺結(jié)核患者，痰培養(yǎng)陽性233例；其中菌種鑒定結(jié)果為MTB感染者222例，菌種鑒定結(jié)果為NTM感染者11例。痰培養(yǎng)結(jié)果為陰性的患者9例，結(jié)合臨床資料，此9例患者最終確診為涂陽培陰肺結(jié)核患者。對(duì)照組患者培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

二、SAT檢測(cè)的符合率

疑似肺結(jié)核組以菌種鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)陽性菌種鑒定結(jié)果為MTB感染的222例患者中SAT檢測(cè)陽性者192例，SAT檢測(cè)結(jié)果與菌種鑒定結(jié)果的符合率為86.5%(192/222)；培養(yǎng)陽性菌種鑒定結(jié)果為NTM感染的11例患者中SAT檢測(cè)陽性者0例(0/11)，與菌種鑒定結(jié)果的符合率為100.0%(11/11)；對(duì)照組SAT檢測(cè)陽性者2例(2.1%，2/96)，均為肺炎患者，與MTB培養(yǎng)的符合率為97.9%(94/96)。

表1 SAT檢測(cè)結(jié)果在不同組別患者中與培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果的比較

注“培養(yǎng)”指痰分枝桿菌培養(yǎng)

三、SAT在疑似肺結(jié)核患者診斷中的意義

SAT對(duì)疑似肺結(jié)核患者診斷的敏感度為86.5%(192/222)，特異度為97.9%(94/96)(表1)。

討 論

一、SAT檢測(cè)對(duì)疑似肺結(jié)核的診斷效率評(píng)估

從本研究結(jié)果可以看出，以菌種鑒定結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，非結(jié)核病患者為陰性標(biāo)準(zhǔn)，SAT檢測(cè)在疑似肺結(jié)核診斷中的敏感度為86.5%，特異度為97.9%。從檢測(cè)時(shí)間上看，SAT檢測(cè)只需2～3 h就能得到結(jié)果，速度明顯快于培養(yǎng)法[2]，而檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)法一致率達(dá)86.5%，說明SAT檢測(cè)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確率為86.5%的檢測(cè)結(jié)果。本研究9例培養(yǎng)陰性的臨床診斷肺結(jié)核患者的標(biāo)本有2例 SAT檢測(cè)為陽性，提示SAT檢測(cè)有助于早期快速發(fā)現(xiàn)傳染源、及時(shí)診治肺結(jié)核患者，減少結(jié)核病的傳播。

將本研究與蔡杏珊等[11]和黃芳等[12]國(guó)內(nèi)同類研究比較，結(jié)果相仿；但崔振玲等[13]研究報(bào)道的對(duì)于痰涂片陽性的標(biāo)本，SAT檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核的診斷敏感度可達(dá)97.6%。本研究222例培養(yǎng)陽性、菌種鑒定為MTB的患者中有30例SAT檢測(cè)結(jié)果為陰性，SAT檢測(cè)與菌種鑒定的符合率為86.5%，而非100.0%，說明可能產(chǎn)生了假陰性結(jié)果，也可能由于本研究的痰SAT和涂片培養(yǎng)檢測(cè)不是同一份痰標(biāo)本，標(biāo)本的異質(zhì)性可能導(dǎo)致不同方法的檢出結(jié)果出現(xiàn)差異。每例患者多份標(biāo)本進(jìn)行SAT檢測(cè)可能會(huì)提高陽性檢出率。

崔振玲等[13]研究報(bào)道，SAT檢測(cè)對(duì)臨床確診的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本檢出率為54%，高于羅氏培養(yǎng)法(42%)，未發(fā)現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；本研究對(duì)照組出現(xiàn)2例假陽性，均為肺炎患者。雖然RNA在環(huán)境中極易降解，不容易發(fā)生實(shí)驗(yàn)污染，出現(xiàn)假陽性的概率較低，但本研究中SAT-TB檢查仍有2例假陽性，經(jīng)患者追蹤，此2例肺炎患者經(jīng)抗炎治療后病灶完全吸收，排除肺結(jié)核。提示在實(shí)驗(yàn)室操作環(huán)節(jié)仍有出現(xiàn)標(biāo)本污染的可能，應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范各項(xiàng)操作，避免人為因素降低其檢驗(yàn)效能。

將SAT技術(shù)與目前其他分子生物學(xué)診斷方法，如Xpert MTB/RIF進(jìn)行比較，張青和閆麗萍[14]Meta分析顯示，用Xpert MTB/RIF診斷肺結(jié)核的敏感度為89%，特異度為98%。本研究顯示SAT檢測(cè)效能與Xpert MTB/RIF相比，有較高的診斷肺結(jié)核的敏感度和特異度，同時(shí)檢查成本較Xpert MTB/RIF更低。

二、SAT檢測(cè)在NTM肺病診斷中的應(yīng)用

SAT的檢測(cè)周期短，除了和培養(yǎng)法一樣能夠檢測(cè)鑒別活菌外，還能區(qū)分MTB與NTM感染。近年來，隨著AIDS的流行，醫(yī)原性感染機(jī)會(huì)增多，各種免疫抑制劑的使用，人口老齡化等問題，NTM肺病較以前明顯增加，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[15]。單憑涂片法和培養(yǎng)法難以區(qū)分NTM菌株。在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，NTM肺病可長(zhǎng)期被誤診為結(jié)核病[16]。本研究入組的242例疑似肺結(jié)核患者，痰抗酸桿菌涂片連續(xù)3次陽性并同時(shí)進(jìn)行了痰SAT檢測(cè)、MTB培養(yǎng)和菌種鑒定等檢查。菌種鑒定結(jié)果顯示，MTB感染者222例，NTM感染者11例，NTM菌株在疑似肺結(jié)核患者中的檢出率為4.5%(11/242)。劉志輝等[17]報(bào)道，1994—2003年10年間廣州市結(jié)核病肺部腫瘤防治所門診患者的NTM分離率在3.51%～10.06%之間，平均分離率為6.28%。羅春明等[18]報(bào)道廣州地區(qū)2003—2012年10年間的NTM分離率高達(dá)20.00%，年分離率從2003年的12.87%上升至2012年的24.22%。

臨床確診NTM肺病的金標(biāo)準(zhǔn)是分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定，耗時(shí)長(zhǎng)且需要使用不同類型的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度使細(xì)菌獲得最優(yōu)生長(zhǎng)[19]，不能滿足臨床早期快速診斷的需要，有一定的局限性。

建議對(duì)于痰抗酸桿菌涂片陽性患者，有胸部影像學(xué)檢查結(jié)果支持，考慮診斷為肺結(jié)核前，可行SAT檢測(cè)協(xié)助診斷，并行分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定。SAT檢測(cè)陽性，支持肺結(jié)核的診斷，再開始進(jìn)行抗結(jié)核治療；SAT檢測(cè)陰性，需排除NTM肺病，等待分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果。采用此方法，可降低耗時(shí)和檢測(cè)成本，對(duì)于早期避免誤診和漏診具有重要意義。

三、小結(jié)

綜上所述，SAT檢測(cè)在2～3 h內(nèi)可以準(zhǔn)確獲得檢測(cè)結(jié)果，在臨床簡(jiǎn)單易行，在疑似肺結(jié)核患者中開展SAT檢測(cè)，對(duì)肺結(jié)核早期診斷及減少漏診、誤診具有重要臨床意義。

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2017-05-10)

(本文編輯：郭萌)

Clinicalsignificanceofusingthesimultaneousamplificationandtestingmethod(SAT)intheearlydiagnosisofsuspectedpulmonarytuberculosis

JIANGWan-hang,WEIAn-na,PANGHui-min,TANShou-yong.

GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

TANShou-yong,Email: 13802930679@163.com

ObjectiveTo investigate the clinical significance of using the simultaneous amplification and testing method (SAT) in the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.MethodsThree hundred and thirty-eight cases with respiratory disease (including 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis and 96 cases with non-tubercular and other lung diseases) admitted in Guangzhou Chest Hospital from July to December 2015 were recruited in the study. Sputum samples were submitted for testing for SAT, smear, culture and strain identification. The number of cases of infection withMycobacteriumtuberculosis, and non-tuberculosis mycobacteria were determined. The coincidence rate of SAT and MTB culture, SAT and strain identification were calculated, and the sensitivity and specificity of SAT in the detection of suspected pulmonary tuberculosis was determined.ResultsOf the 242 cases with suspected pulmonary tuberculosis, 233 cases were sputum culture positive, 222 cases were infected withMycobacteriumtuberculosis, and 11 cases with non-tubercular mycobacteria, 96 cases with non-tubercular and other lung diseases were sputum culture negative. In the MTB group, 192 cases were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 86.5% (192/222). In the NTM group, no case (0/11) were SAT positive, and the coincidence rate of SAT and strain identification was 100.0% (11/11). Of the 96 cases with non-tubercular and other lung diseases, 2 cases were SAT positive (2.1%, 2/96), and the coincidence rate of SAT with MTB culture and strain identification was 97.9% (94/96). The sensitivity of SAT in the diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis was 86.5% (192/222), and the specificity was 97.9% (94/96).ConclusionThe use of the SAT assay has important clinical significance for the early diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Nucleic acid amplification techniques; Early diagnosis; Mycobacterium infections, atypical; Respiratory tract diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.12.011

廣州市科技計(jì)劃課題(155700012)

510095 廣州市胸科醫(yī)院

譚守勇，Email：tanshouyong@163.com