孫貴祥，朱建建，馬伯恒，高躍強

腦梗死患者血漿中同型半胱氨酸、維生素B12與葉酸表達水平研究

孫貴祥，朱建建，馬伯恒，高躍強

目的：探討腦梗死患者血漿中同型半胱氨酸、維生素B12與葉酸表達水平與血管性癡呆的關系。方法：采用高效液相色譜法檢測受試者（腦梗死患者血管性癡呆組、腦梗死患者非癡呆組、健康對照組）血漿Hcy、維生素B12及葉酸水平，并觀察MTHFR基因型在不同組間分布情況。結果：血管性癡呆組的血漿Hcy水平明顯高于非癡呆組、健康對照組（P＜0.05），而維生素B12及葉酸水平明顯低于非癡呆組和健康對照組（P＜0.05）。不同病情嚴重程度腦梗死血管性癡呆患者間Hcy、維生素B12及葉酸水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。MTHFR基因型在各組間分布情況差異也無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：血漿中Hcy、維生素B12及葉酸水平可能與血管性癡呆有關。

血管性癡呆；同型半胱氨酸；維生素B12；葉酸

血管性癡呆是老年期常見的認知障礙疾病之一，發(fā)病率僅次于阿爾茲海默病，常與阿爾茲海默病共存，有時甚至對阿爾茲海默病病情有加重作用，故對于血管性癡呆的臨床研究更具實際意義[1,2]。迄今為止，有關血管性癡呆的病理機制尚未明確[3]。多數(shù)學者認為腦梗死為血管性癡呆發(fā)病的主要原因[4]。血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的升高易導致人體腦血管發(fā)生病變，進而引發(fā)腦功能衰退、腦梗死等[5]。影響Hcy體內濃度的因素除N5,N10-亞甲四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）外，維生素B12及葉酸對Hcy的代謝過程也有一定影響[6,7]。為進一步研究血管性癡呆病理機制，本文對Hcy、維生素B12與葉酸表達水平與腦梗死患者血管性癡呆的關系進行探討，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年～2015年我科收治的住院患者，腦梗死患者血管性癡呆組的納入標準：在腦血管病發(fā)生后3～6月，患者自述出現(xiàn)認知功能障礙或記憶力減退者；依據Roman研究標準[8]，根據長谷川癡呆量表、蒙特利爾認知評估量表、簡易精神狀態(tài)檢查表及Hachinski缺血量表對患者評估做出血管性癡呆的診斷，患者長谷川癡呆量表得分≥7分，蒙特利爾認知評估量表得分≤26分，簡易精神狀態(tài)檢查表得分≤26分，Hachinski缺血量表得分≥7分；經腦核磁共振檢測顯示，患者腦白質、腦皮質以及雙側基底核出現(xiàn)多發(fā)性、長T2或長T1病灶；經腦CT檢查發(fā)現(xiàn)患者基底核區(qū)、大腦白質出現(xiàn)多發(fā)或單發(fā)性腔隙梗死，腦室周圍出現(xiàn)缺血性白質疏松。腦梗死患者非癡呆組納入標準：患者的腦核磁共振檢測以及腦CT檢測均符合第四屆全國腦血管病會議制定的腦梗死診斷標準[9]；經長谷川癡呆量表、蒙特利爾認知評估量表、簡易精神狀態(tài)檢查表及Hachinski缺血量表測試未出現(xiàn)癡呆；與腦梗死患者血管性癡呆組同期入院接受治療。健康對照組納入標準：經腦核磁共振檢測及腦CT檢測未見腦梗死病灶；經長谷川癡呆量表、蒙特利爾認知評估量表、簡易精神狀態(tài)檢查表及Hachinski缺血量表測試未出現(xiàn)癡呆。排除標準：甲狀腺功能減退；有抑郁癥、躁狂癥等中樞神經系統(tǒng)疾??；服用改善認知、抗抑郁及抗癲癇的藥物；服用維生素B12、維生素B6及葉酸；伴嚴重肝、心、腦、腎及血液性疾病。入選者對本研究知情，且自愿簽署知情同意書。最終血管性癡呆組納入42例，其中男22例，女20例；年齡 61～74歲，平均（65.1±3.4）歲；根據簡易精神狀態(tài)檢查表評分情況將其進一步分為輕度（20～26分）13例、中度（10～20分）15例、重度（＜10分）14例。非癡呆組納入40例，其中男21例，女19例；年齡60～75歲，平均（66.7±5.6）歲。健康對照組30例，其中男16例，女14例；年齡 60～76歲，平均（64.9±3.8）歲。各組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血漿中Hcy、維生素B12及葉酸濃度檢測 于入院次日清晨空腹采集入選者肘靜脈血4 mL，分離血漿后采用高效液相法對血漿中Hcy、維生素B12及葉酸進行檢測。具體檢測步驟按文獻[10-12]所述方法進行：①Hcy：流動相為50 mmol/L磷酸二氫鉀-50 ml/L甲醇，流速為1.0 mL/min，采用脈沖電流檢測器檢測；②維生素B12：流動相為0.03 mmol/L磷酸二氫鉀-乙腈（85∶15），流速為1.0 mL/min，采用紫外檢測器檢測，波長為361 nm；③葉酸：流動相為0.1%甲酸水-乙腈（85∶15），流速為1.0 mL/min，采用質譜檢測器檢測。

1.2.2 MTHFR基因型檢測 于入院次日清晨空腹采集入選者肘靜脈血4 mL，參照文獻[13]方法提取DNA。引物序列為 5’-TGA AGG AGA TGT CTG CGG GA-3’和5’-AGC ACG GTG CGG GAG TG-3’，購置于中科院上海細胞研究所。PCR系統(tǒng)具體條件為：94℃30 s，62℃45 s，72℃50 s，30個循環(huán)后采用72℃延伸 10 min。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據以（平均值±標準差）表示，t檢驗；計數(shù)數(shù)據采用百分比[n(%)]表示，χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因型鑒定

MTHFR基因經PCR擴增后產生198 bp片段（圖1A）。該位點為C/T二態(tài)SNP。PCR擴增產物經酶切后產生175 bp和23 bp兩種長度片段，故可以分出三種基因型：未突變純合子C/C，可見一條電泳帶為198 bp；突變純合子T/T，可產生175 bp和23 bp兩種片段；突變雜合子C/T，可見3條電泳帶，分別為198 bp、175 bp和23 bp（圖1B）。

圖1 MTHFR基因型鑒定

2.2 不同組間Hcy、維生素B12及葉酸水平比較

血管性癡呆組血漿Hcy水平明顯高于非癡呆組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），維生素B12及葉酸水平明顯低于非癡呆組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 不同病情嚴重程度血管性癡呆患者中Hcy、維生素B12、葉酸及水平比較

不同病情嚴重程度的血管性癡呆患者血漿Hcy維生素B12及葉酸水平間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.4 MTHFR基因型在不同組間分布情況

不同組間MTHFR基因型差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表1 不同組間Hcy、維生素B12及葉酸水平比較

表2 不同病情嚴重程度血管性癡呆患者中Hcy、維生素B12、葉酸水平比較

表3 MTHFR基因型在不同組間分布情況

3 討論

血管性癡呆是僅此于阿爾茲海默癥的第二位常見的持續(xù)性、獲得性認知功能障礙綜合征，根據病理特點及臨床特征主要分為大面積梗死性癡呆、多發(fā)梗死性癡呆、分水嶺區(qū)梗死性癡呆、單個重要部位梗死性癡呆等7種類型[14]。有關血管性癡呆的發(fā)病機制至今尚未有明確定論。學者認為炎性反應、膽堿能通路抑制、血管內皮損傷、缺血再灌損傷、遺傳因素等均有可能引發(fā)血管性癡呆[15]。而大多數(shù)學者認為，腦梗死是造成患者血管性癡呆的最重要因素。

不少研究表明血漿中Hcy濃度與腦梗死具有一定相關性，腦梗死患者血漿內Hcy水平明顯高于正常組，Hcy成為腦梗死的獨立危險因素[16,17]。本研究結果顯示，血管性癡呆組及非癡呆組患者血漿中Hcy水平高于健康對照組（P＜0.05）,血管性癡呆組的血漿Hcy水平高于非癡呆組（P＜0.05），提示Hcy水平升高可能也是血管性癡呆的危險因素。而高Hcy引發(fā)患者出現(xiàn)腦梗死及血管性癡呆的可能機制為：①血管內皮損傷：體內過氧化氫以及氧自由基易造成血管內皮細胞損傷，Hcy化的蛋白質進而結合相應抗體，免疫性攻擊血管內皮，造成內皮損傷，動脈粥樣硬化，增加腦梗死發(fā)率[18]；②Hcy通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體及其亞型，激發(fā)氧自由基的產生以及鈣離子的超載，進而對毒物介導的細胞外毒作用起到興奮作用，同時促進神經細胞的凋亡，最終對神經傳導功能造成危害[19]。③Hcy參與S-腺苷代謝過程，抑制S-腺苷的分解，引發(fā)磷脂及蛋白質的甲基化過程受阻、單胺類神經遞質的代謝中斷，造成海馬神經元死亡，損傷患者記憶及認知能力[20]。

由于人體內Hcy的甲基化代謝過程需在維生素B12以及葉酸的催化下完成，一旦體內葉酸、維生素B12水平降低，就會導致Hcy甲基化過程受阻，進而引起血漿中Hcy水平升高。此外，MTHFR也是體內葉酸代謝的關鍵酶，在DNA甲基化、葉酸代謝及DNA修復中起重要作用。當MTHFR基因中677位點處發(fā)生C-T突變時，MTHFR酶的活性會顯著降低[21]，進而影響Hcy代謝過程，造成血漿Hcy水平升高。因此，為全面考察血管性癡呆患者體內Hcy的累積原因，本研究對患者維生素B12、葉酸水平及MTHFR基因進行監(jiān)測。結果顯示，血管性癡呆組及非癡呆組患者血漿中維生素B12及葉酸水平顯著低于健康對照組（P＜0.05），血管性癡呆組的血漿維生素B12及葉酸水平明顯低于非癡呆組（P＜0.05），說明維生素B12以及葉酸水平降低，Hcy代謝途徑受阻，體內Hcy水平升高，易造成血管性癡呆。但觀察不同組間MTHFR基因型差異時發(fā)現(xiàn)，不同組別間基因型以及等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能由于實驗例數(shù)較少所致。

研究不同病情嚴重程度血管性癡呆患者體內Hcy、維生素B12以及葉酸水平差異時發(fā)現(xiàn)，輕度、中度及重度患者體內三指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明體內Hcy、維生素B12及葉酸水平變化與血管性癡呆的病變程度關系較小。

綜上所述，腦梗死血管性癡呆患者體內Hcy水平高于無癡呆性腦梗死患者及健康志愿者，維生素B12及葉酸水平低于無癡呆性腦梗死患者及健康志愿者，增加葉酸及B族維生素的攝入或可有助于預防腦梗死血管性癡呆的發(fā)生。

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Study on Plasma Homocysteine,Vitamin B12,Folic Acid Levels in Cerebral Infarction Patients

SUN Gui-xiang,ZHU Jian-jian,MA Bo-heng,GAO Yue-qiang.Department of Neurology,Rugao People's Hospital,Jiangsu 226500,China

Objective:To investigate relations between plasma homocysteine,vitamin B12,folic acid levels and vascular dementia in cerebral infarction patients.Methods:The plasma homocysteine,vitamin B12,folic acid levels of vascular dementia group,non-infarct dementia group and health control group were analyzed by using HPLC.The polymorphisms of methylenetetrahydrofolate(MTHFR)reductase gene in different group were also observed.Re?sults:The plasma homocysteine levels of vascular dementia group were much higher than those of non-infarct dementia group and health control group(P＜0.05),while the vitamin B12,folic acid levels of vascular dementia group were much lower than those of non-infarct dementia group and health control group(P＜0.05).There were no significant differences in level of homocysteine,vitamin B12and folate between different level of vascular dementia group(P＞0.05).The polymorphisms of MTHFR reductase gene in the different groups showed no significant differences(P＞0.05).ConclusionThe plasma homocysteine,vitamin B12,and folic acid levels have relations with vascular dementia.

vascular dementia;plasma homocysteine;vitamin B12;folic acid

R741;R741.02;R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.011

如皋市人民醫(yī)院神經內科江蘇 如皋 226500

2016-11-16

孫貴祥jhmali100@163.com

（本文編輯：王晶）