韓瑞玲，陳進(jìn)，吳薇，李艷

缺血性腦卒中患者血漿同型半胱氨酸水平和MTHFR基因多態(tài)性分析

韓瑞玲，陳進(jìn)，吳薇，李艷

目的：探討缺血性腦卒中患者血漿同型半胱氨酸（HCY）水平和亞甲基四氫葉酸還原酶基因MTHFR多態(tài)性的關(guān)系。方法：缺血性腦卒中患者181例納入卒中組，健康人126例納入對(duì)照組。檢測(cè)2組HCY、葉酸、VitB12水平、MTHFR基因多態(tài)性及一般情況，并分析不同基因型的腦卒中患者血漿HCY、葉酸、VitB12水平。結(jié)果：卒中組的HCY水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而VitB12、葉酸水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。卒中組MTHFR基因TT純合子率及T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而C/C野生型頻率及C等位基因頻率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。卒中組MTHFR基因C/T雜合突變型及T/T純合突變型HCY水平均顯著性高于對(duì)照組，T/T純合突變型葉酸水平顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05）。卒中組內(nèi)T/T純合突變型HCY水平顯著高于C/C野生型及C/T雜合突變型，葉酸水平顯著低于C/C型和C/T型（P＜0.05）。結(jié)論：缺血性腦卒中患者M(jìn)THFR基因677位點(diǎn)的純合突變可能是血漿HCY水平升高的影響因素，葉酸、VitB12缺乏亦與HCY升高有關(guān)聯(lián)。

同型半胱氨酸；MTHFR基因；缺血性腦卒中；基因多態(tài)性

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinernia）已被公認(rèn)為動(dòng)靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1]。血漿同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）水平升高的主要原因有營(yíng)養(yǎng)因素和遺傳性因素，前者由于HCY代謝中的輔酶如葉酸、維生素B（Vitamin B，VitB）12或VitB6攝入不足，后者是因?yàn)镠CY代謝相關(guān)酶基因突變所導(dǎo)致的代謝功能缺陷[2]，其中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的基因多態(tài)性與人體HCY的增高相關(guān)[3,4]。本研究通過(guò)對(duì)缺血性腦卒中患者血漿HCY、葉酸、VitB12濃度及MTHFR基因677位點(diǎn)多態(tài)性分析，為利用個(gè)體遺傳特征進(jìn)行缺血性腦卒中的預(yù)防和早期治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月至2016年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性缺血性腦卒中患者181例為卒中組，漢族，無(wú)血緣關(guān)系。所有患者均符合中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)顱腦CT和（或）MRI檢查確診。選擇同期健康體檢者126例為對(duì)照組，漢族，無(wú)血緣關(guān)系，均無(wú)腦梗死或其他腦血管病變，心電圖正常。排除糖尿病、腫瘤、肝腎功能異常、甲狀腺功能異常及血液病等患者，排除近1個(gè)月內(nèi)服用甲氨蝶呤、葉酸、B族維生素及抗瘧藥物等影響HCY的藥物者。

1.2 主要試劑和儀器

BR-526-24全自動(dòng)雜交儀、BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀購(gòu)于上海百傲科技有限公司，ADVIA Centaur XP全自動(dòng)免疫分析儀購(gòu)于德國(guó)西門子公司，T100 PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-rad公司。全血基因組DNA提取試劑盒、MTHFR基因檢測(cè)DNA微陣列芯片法試劑盒購(gòu)于上海百傲科技有限公司。HCY測(cè)定試劑盒、VitB12測(cè)定試劑盒、葉酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)于德國(guó)西門子公司。

1.3 方法

1.3.1 血漿HCY、VitB12、葉酸濃度測(cè)定 受試者肘靜脈采血2 mL（EDTA抗凝），離心分離血漿，－20℃保存。按照HCY、VitB12、葉酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書，采用化學(xué)發(fā)光免疫競(jìng)爭(zhēng)法分別測(cè)試受試者血漿樣本中HCY、VitB12、葉酸濃度。

1.3.2 MTHFR基因分型檢測(cè)[6]受試者經(jīng)肘靜脈采集外周血2 mL（EDTA抗凝），按照全血DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取和純化。按照MTHFR基因檢測(cè)DNA微陣列芯片法試劑盒說(shuō)明書，使用生物素標(biāo)記的MTHFR基因特異性熒光引物對(duì)已純化的DNA標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用全自動(dòng)雜交儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交及顯色，隨后用生物芯片識(shí)讀儀及基因芯片圖像分析軟件（Baio Array Doctor V 2.0）判讀MTHFR 677位點(diǎn)的等位基因，并定義為野生型（C/C）、雜合突變型（C/T）、純合突變型（T/T）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，2組比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算各等位基因頻率分布數(shù)據(jù)的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 2組基本情況比較

卒中組的收縮壓水平及HCY水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而VitB12、葉酸水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。2組年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓患病率、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）及高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 2組一般情況比較

2.2 2組MTHFR基因分布頻率比較

本研究卒中組MTHFR等位基因分布的頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），故認(rèn)為群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w，見(jiàn)表2。MTHFR基因型多態(tài)性的總體分布情況見(jiàn)表3。卒中組MTHFR基因TT純合子率及T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而C/C野生型頻率及C等位基因頻率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 MTHFR基因多態(tài)性與血漿HCY、VitB12、葉酸水平的關(guān)系

本研究中卒中組MTHFR基因C/T雜合突變型及T/T純合突變型HCY水平均顯著性高于對(duì)照組，T/T純合突變型葉酸水平顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表4。卒中組內(nèi)T/T純合突變型HCY水平顯著高于C/C野生型（P=0.011）及C/T雜合突變型（P=0.018），葉酸水平顯著低于C/C型（P=0.001）和C/T型（P=0.011）。對(duì)照組內(nèi)T/T純合突變型HCY水平顯著高于C/C野生型（P=0.048）及C/T雜合突變型（P=0.044），維生素B12水平顯著低于C/C型（P=0.014），葉酸水平顯著低于C/C型（P=0.001），見(jiàn)表4。

表2 卒中組MTHFR C677T基因Hardy-Weinberg遺傳平衡分析

表3 各組MTHFR基因型及等位基因頻率分布[例(%)]

表4 MTHFR基因多態(tài)性與血漿HCY、VitB12、葉酸水平（±s）

表4 MTHFR基因多態(tài)性與血漿HCY、VitB12、葉酸水平（±s）

注：與組內(nèi)T/T比較，①P＜0.05

組別 例數(shù)HCY/(μmol/L)對(duì)照組卒中組t值P值126 181 C/C 10.66±4.69①14.68±4.12①1.439 0.188 C/T 10.44±3.27①16.10±4.34①2.329 0.048 T/T 17.11±5.76 26.30±10.85 2.829 0.022組別VitB12/(pg/mL)對(duì)照組卒中組t值P值C/C 555.51±114.37①397.11±119.70 2.139 0.065 C/T 502.78±73.96 386.94±128.49 1.747 0.119 T/T 371.87±109.01 262.35±105.64 1.613 0.145組別 葉酸/(ng/mL)對(duì)照組卒中組t值P值C/C 10.39±1.60①7.65±2.30①2.181 0.061 C/T 7.51±1.59 5.95±1.12①1.800 0.110 T/T 5.71±2.08 3.048±1.35 2.405 0.043

3 討論

HCY是人體甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，高HCY是腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HCY的代謝需要MTHFR、葉酸、VitB12的共同參與。MTHFR是HCY代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為N-5-甲基四氫葉酸，從而提供甲基使HCY甲基化為甲硫氨酸[7,8]，此過(guò)程還需要輔酶VitB12的參與[9,10]。因此，MTHFR活力下降及葉酸、VitB12缺乏均是導(dǎo)致HCY升高的重要原因。MTHFR功能缺陷或活性下降的主要原因?yàn)镸THFR基因的錯(cuò)義突變，最常見(jiàn)的基因多態(tài)性為677位點(diǎn)的C→T堿基突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，酶活性降低，MTHFR的結(jié)構(gòu)蛋白與葉酸結(jié)合能力下降，血漿HCY水平升高，增加了血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。MTHFR基因677位點(diǎn)具有3種多態(tài)性（C/C、C/T、T/T），其中純合突變型（T/T）編碼的酶活性比野生型（C/C）編碼的正常酶活性降低55%以上[11]，酶活性下降導(dǎo)致HCY水平不同程度升高。

本研究中，卒中組和對(duì)照組T/T型血漿HCY水平均顯著高于本組C/C型和C/T型，說(shuō)明T/T組MTHFR的酶活性最低，T/T突變是血栓性疾病的重要遺傳性風(fēng)險(xiǎn)因素。這與北京[12]、河北[13]、重慶[14]、湖南[15]及印度[16]等地區(qū)報(bào)導(dǎo)一致。此外，陳素峰[17]等對(duì)浙江286例老年心腦血管病患者研究表明腦血管患者HCY顯著升高，而與MTHFR基因多態(tài)性無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，但該研究報(bào)導(dǎo)的MTHFR基因突變時(shí)葉酸水平明顯下降與本研究相似，表明具有MTHFR基因多態(tài)性的患者應(yīng)該注重補(bǔ)充葉酸及VitB12。本研究與這些報(bào)道不盡相同的原因在于腦血管疾病是多因素的，研究對(duì)象的遺傳背景不同、飲食習(xí)慣不同及選擇標(biāo)準(zhǔn)不同均有可能導(dǎo)致分析的差異。此外，本研究表明卒中組收縮壓較對(duì)照組顯著升高，這是因?yàn)椴±MHCY過(guò)高引起的血管內(nèi)皮損傷、抑制擴(kuò)管物質(zhì)一氧化氮和前列環(huán)素合成、降低動(dòng)脈壁彈性、增加外周血管阻力等[18]，而葉酸、VitB12缺乏作為HCY升高的營(yíng)養(yǎng)因素，在本研究中與收縮壓升高顯示出一定關(guān)聯(lián)。由于本研究納入的病例僅為武漢大學(xué)人民醫(yī)院就診的部分人群，存在一定的片面性，需要進(jìn)行多地區(qū)大數(shù)據(jù)分析調(diào)查，才能取得更有價(jià)值的資料。

本研究表明MTHFR基因677位點(diǎn)的純合突變可能是血漿HCY水平升高的影響因素，葉酸、VitB12缺乏亦與HCY升高有關(guān)。臨床醫(yī)生在條件允許的前提下，可以同時(shí)檢測(cè)患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性及HCY水平，以結(jié)合遺傳特征早期采取預(yù)防或治療措施，實(shí)行個(gè)體化用藥方案。

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The Relationship between Plasma Level of Homocysteine and Polymorphism Distribution of MTHFR Gene in Patients with Ischemic Stroke

HAN Rui-ling,CHEN Jin,WU Wei,LI Yan.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To investigate the relationship between the homocysteine(HCY)level and polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)gene in patients with ischemic stroke in Wuhan.Methods:One hundred and eighty-one stroke patients(stroke group)and 126 healthy volunteers(control group)were enrolled.The plasma levels of HCY,folic acid,VitB12and the MTHFR gene polymorphism were compared between the 2 groups.The plasma levels of HCY,folic acid and VitB12were compared among patients with different genotypes in the stroke group.Re?sults:The plasma level of HCY was significantly higher in the stroke patients than that in the control ones(P＜0.05).While the levels of folic acid and VitB12were significantly lower in the stroke patients than those in the control group(P＜0.05).There was a significant difference in the allele of the MTHFR gene in the T allele rate and T/T rate between the 2 groups(P＜0.05).In addition,the level of HCY in patients with homozygous mutant(T/T)and heterozygotes mutant(C/T)was significantly higher than that in the control group(P＜0.05).In stroke group,the level of HCY in homozygous mutant(T/T)was significantly higher than that of C/C wild type and C/T heterozygous mutant,and the level of folic acid of T/T was significantly lower than that of C/C and C/T(P＜0.05).Conclusion:MTHFR gene 677 locus homozygous mutation may be a factor for the increase of plasma HCY level in ischemic stroke patients,as well as the levels of folic acid and VitB12.

homocysteine;MTHFR gene;ischemic stroke;gene polymorphism

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.005

武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科武漢430060

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81501427，81200389）湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2016CFB456）

2017-05-27

李艷yanlitf1120@163.com

（本文編輯：唐穎馨）