倪 琳，魏學冰，李若綺

（甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070）

清氣化痰丸的質(zhì)量標準提高研究

倪 琳，魏學冰，李若綺

（甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070）

目的 提高清氣化痰丸的質(zhì)量標準。方法 采用薄層色譜法（TLC）對制劑中半夏、陳皮、茯苓、苦杏仁進行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中橙皮苷、黃芩苷和苦杏仁苷的含量，色譜柱：CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.4%磷酸（B）溶液為流動相梯度洗脫，流速 1.0 ml/min，檢測波長 222 nm，柱溫 30℃，進樣量為 10 μl。結(jié)果 半夏、陳皮、茯苓、苦杏仁的TLC圖斑點清晰，分離度較好，陰性對照無干擾。橙皮苷、黃芩苷、苦杏仁苷檢測質(zhì)量控制線性范圍分別為 10.68～53.40 μg/min（r=0.999 3），43.60～218.00 μg/min（r=0.999 9），23.02～115.10 μg/min（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜1.00%，加樣回收率分別為96.62%～103.42%（RSD=2.86%，n=6），95.58%～101.51%（RSD=2.03%，n=6），96.14%～102.72%（RSD=2.89%，n=6）。結(jié)論 該標準可用于清氣化痰丸的質(zhì)量控制。

清氣化痰丸；橙皮苷；黃芩苷；苦杏仁苷；質(zhì)量標準

清氣化痰丸由黃芩（酒炒）、瓜蔞仁霜、半夏（制）、陳皮、膽南星、生姜、苦杏仁、枳實、茯苓九味中藥材組成，具有清肺化痰功效，臨床上用于治療肺熱咳嗽，痰多黃稠、胸脘滿悶等癥[1]。該制劑現(xiàn)執(zhí)行《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑（第七冊）》中的標準，原標準僅有鑒別及常規(guī)檢查項，不利于藥品質(zhì)量控制，為了更好地控制其質(zhì)量，有必要對現(xiàn)行標準進行修訂。本研究采用薄層色譜法（TLC）對制劑中半夏、陳皮、茯苓、苦杏仁四味藥材進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對制劑中的主要有效成分橙皮苷、黃芩苷、苦杏仁苷進行定量分析，為提高其質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Alliance e2695型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（Waters 2998）；KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，200 W，40 kHz）；Mettler AE240電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

清氣化痰丸（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：15C1-1、15J2-1、15J3-1，規(guī)格：每6丸相當于原生藥3 g）。橙皮苷對照品（批號：110721-201316，純度：93.3%），黃芩苷對照品（批號：110715-201318，純度：93.3%），苦杏仁苷對照品（批號：110820-201508，純度：93.4%），半夏對照藥材（批號：121272-200401），陳皮對照藥材（批號：120969-201109），枳實對照藥材（批號：120936-201005），茯苓對照藥材（批號：121090-201002），苦杏仁對照藥材（批號：121554-200702）均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 半夏 取樣品5 g，研細，加乙醇25 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇3 ml使溶解，作為供試品溶液。取半夏對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備半夏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2]試驗，取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-丙酮- 甲酸（30∶60∶4∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.1.2 陳皮、枳實 取樣品3 g，研細，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。取陳皮、枳實對照藥材各1 g，分別同法制成對照藥材溶液；再取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備陳皮、枳實的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2]試驗，取上述4種溶液各3 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇 - 水（40∶7∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1.3 茯苓 取樣品5 g，研細，加乙醚50 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取茯苓對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備茯苓的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2]試驗，取供試品溶液、陰性對照品溶液5 μl，對照藥材溶液10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯 - 乙酸乙酯 - 甲酸（20∶5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸試液-乙醇（4∶1）混合溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.1.4 苦杏仁 取樣品5 g，研細，加甲醇50 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。取苦杏仁對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備苦杏仁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按TLC法[2]試驗，取供試品溶液、陰性對照品溶液5 μl、對照藥材溶液10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯 - 甲醇 - 水（15∶40∶22∶10）5～10℃放置 12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，立即用含0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈（254 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.2 橙皮苷、黃芩苷、苦杏仁苷的含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗 色譜柱選用CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B）梯度洗脫，0～10 min，A 為 15%，B為 85%；11～50 min，A 為25%，B為75%；51～80 min，A為15%，B為85%；檢測波長為222 nm；柱溫 30℃，流速：1.0 ml/min，進樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以苦杏仁苷峰、橙皮苷峰、黃芩苷峰計算均不低于4 000。供試品中的苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷與其他雜質(zhì)峰均能很好地分離，分離度＞1.5。結(jié)果見圖1～2。

圖1 對照品高效液相色譜圖

圖2 供試品高效液相色譜圖

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含苦杏仁苷對照品0.115 1 mg、橙皮苷對照品0.053 4 mg、黃芩苷對照品0.218 0 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品約1 g，研細，精密稱定，精密加入甲醇100 ml，密塞，稱定重量，加熱回流3 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標準曲線的制備 精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，測定峰面積積分值，以對照品質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標（y）進行線性回歸，分別得到回歸方程：苦杏仁苷y=9.759 0×105x+2.820 3×104（r=0.999 9），橙皮苷y=1.855 4×106x+7.760 8×104（r=0.999 3），黃芩苷y=3.706 7×106x-6.931 6×104（r=0.999 6）。結(jié)果表明，苦杏仁苷在23.02～115.10 μg/ml范圍內(nèi)、橙皮苷在 10.68～53.40 μg/ml范圍內(nèi)、黃芩苷在43.62～218.00 μg/ml范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 專屬性試驗 按處方比例及制備工藝，配制不含黃芩、陳皮、枳實、苦杏仁的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果本品在苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷混合對照品相應位置處無色譜峰出現(xiàn)，說明本品陰性無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 陰性對照高效液相色譜圖

2.2.6 儀器精密度試驗 取清氣化痰丸（批號：15C1-1），按“2.2.3”項下方法提取，重復進樣6次，結(jié)果苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.29%、0.44%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取清氣化痰丸（批號：15C1-1），按“2.2.3”項下方法提取供試品6份，測定苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷RSD分別為0.39%、1.22%、0.60%。

2.2.8 加樣回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取已知苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷含量的供試品（批號：15C1-1）6份，每份約0.12 g，精密稱定，分別精密加入一定量的混合對照品溶液（苦杏仁苷0.107 5 mg/ml、橙皮苷0.051 8 mg/ml、黃芩苷0.107 4 mg/ml），用氮吹儀將溶媒吹干，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定供試品中苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷的含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.7”項下樣品，分別在 0、5、10、15、20、25、32 h測定峰面積，苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷峰面積穩(wěn)定，RSD分別為0.95%、0.44%、1.12%，表明供試品溶液在室溫下放置32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 樣品的測定 取清氣化痰丸3批，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 不同溶媒及提取方法的比較

分別以甲醇加熱回流3 h、70%乙醇回流3 h、甲醇超聲3 h提取樣品（批號：15C1-1）中黃芩苷、橙皮苷的含量[3]，結(jié)果：甲醇加熱回流3 h，黃芩苷6.052 mg/g、橙皮苷0.763 mg/g、苦杏仁苷0.772 mg/g）；70%乙醇回流3 h，黃芩苷13.892 mg/g、橙皮苷2.064 mg/g、苦杏仁苷1.029 mg/g；甲醇超聲3 h，黃芩苷0.064 mg/g、橙皮苷1.432 mg/g、苦杏仁苷0.672 mg/g。故以70%乙醇作為溶媒提取樣品，黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量較高。

3.2 考察以70%乙醇作為溶媒，不同提取時間的比較

分別以70%乙醇回流2 h、70%乙醇回流3 h、70%乙醇回流4 h提取樣品（批號：15C1-1）中黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量，結(jié)果：70%乙醇回流2 h，黃芩苷5.022 mg/g、橙皮苷1.221 mg/g、、苦杏仁苷1.002 mg/g；70%乙醇回流3 h，黃芩苷13.894 mg/g、橙皮苷2.062 mg/g、苦杏仁苷1.029 mg/g；70%乙醇回流4 h，黃芩苷 5.072 mg/g、橙皮苷 2.273 mg/g、苦杏仁苷 1.013 mg/g。由結(jié)果看出，70%乙醇回流4 h，橙皮苷的含量較回流3 h高，但黃芩苷的含量不到回流3 h的1/2，故選取以70%乙醇回流提取3 h。

3.3 檢測波長的選擇

在200～400 nm處分別測定黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的最大吸收波長，測得黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷均在222 nm處有最大吸收，故選擇在222 nm處同時測定樣品中黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量[4～6]。

3.4 耐用性考察

本研究比較了不同類型的色譜柱（Agilent Zorbax SB C18、Waters SunFire C18、CAPCELL PAK C18），不同生產(chǎn)廠家（Waters、Agilent、島津公司）的儀器，不同柱溫（25℃、30℃、35℃、40℃）以及不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）的影響，均得到滿意結(jié)果，說明該方法耐用性良好。

3.5 流動相的選擇

對流動相的使用起初參考相關(guān)文獻提出的甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）[7]，由于甲醇在 205 nm處存在末端吸收，故使用乙腈作為流動相。參考相關(guān)文獻[8～11]，采用乙腈（A）-0.4%磷酸（B）梯度洗脫，黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷峰分離度較好、基線噪音小。經(jīng)方法學驗證，該方法線性、精密度、重復性、穩(wěn)定性、準確度、耐用性均符合要求，可作為清氣化痰丸質(zhì)量控制的方法。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會．中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑（第七冊）[S]．1998．

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（四部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015．

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R284

A

1671-1246（2017）23-0081-03