賈子陽，馬長路，賈震虎，逄曉陽，孫劍鋒，*，呂加平，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

干酪乳桿菌SY13在BALB/c小鼠腸道粘附屬性研究

賈子陽1，馬長路2，3，賈震虎3，逄曉陽3，孫劍鋒1，*，呂加平3，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

干酪乳桿菌具有良好的益生功能，在乳制品研究與開發(fā)中廣泛應(yīng)用。利用熒光定量PCR測定外源性干酪乳桿菌SY13在BALB/c小鼠腸道內(nèi)的分布及其在腸道內(nèi)的保留時間。并從灌胃時間和益生元作用兩個方面評價了對粘附能力的影響。結(jié)果表明：灌胃的干酪乳桿菌SY13多分布于宿主的盲腸和結(jié)腸中；灌胃時間和益生元均對干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道內(nèi)的粘附屬性有影響。為干酪乳桿菌SY13在功能性食品的研究與開發(fā)中提供部分的理論依據(jù)。

干酪乳桿菌SY13；BALB/c小鼠；灌胃時間；益生元；粘附

干酪乳桿菌屬于益生菌的一種。能夠耐受人體口腔中的酶，低pH值的胃液，小腸中堿性腸液和膽鹽，進(jìn)而在人體腸道內(nèi)定植，發(fā)揮良好的益生功能[1-4]。干酪乳桿菌在制作功能性酸乳[5]，發(fā)酵豆乳[6-7]，干酪[8]和功能性乳酸菌飲料[9]當(dāng)中廣泛應(yīng)用。由于干酪乳桿菌優(yōu)良的發(fā)酵風(fēng)味和良好的功能性，其在食品研究與開發(fā)中占有重要地位。

益生元是一種膳食補(bǔ)充劑，通過選擇性的刺激一種或少數(shù)種菌落中的細(xì)菌的生長與活性而對寄主產(chǎn)生有益的影響從而改善寄主健康的不可被消化的食品成分。研究表明益生元還具有促進(jìn)神經(jīng)樹突發(fā)育，減少焦慮，刺激免疫，影響礦質(zhì)代謝，提高食物消化率，抗氧化，對抗腫瘤等作用[10-17]。益生元不但在營養(yǎng)方面表現(xiàn)出眾，而且價格相對較低，在功能性食品當(dāng)中廣泛應(yīng)用。

干酪乳桿菌SY13分離自傳統(tǒng)乳制品。經(jīng)研究表明，干酪乳桿菌SY13具有良好的抗氧化功能。益生菌的粘附能力是益生菌功能性評價的一個重要方面。益生菌在人體腸道粘附定植是其進(jìn)一步發(fā)揮益生功能的前提。本研究篩選出了2種有益于干酪乳桿菌SY13生長的益生元。并對有無益生元干預(yù)下BALB/c小鼠空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸進(jìn)行了干酪乳桿菌SY13的檢測。對比分析了益生元對干酪乳桿菌SY13在BALB/c小鼠腸道粘附能力的影響。為干酪乳桿菌SY13在功能性食品的開發(fā)提供部分的理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀（SPARK2M）：瑞士帝肯商貿(mào)有限公司；熒光定量PCR儀（ABI 7500）：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司；超純水：美國Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)；TaqMan?Universal PCR Master Mix（4304437）：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司；糞便基因組DNA提取試劑盒（DP328）：天根生化科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-T-CS：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所呂加平課題組實驗室合成。上游引物引物，06232F：TCAACCGTGACTGGCAAGT；下游引物，06232R：AGCGGCTTGTCGAACTGA；探針，06232P：FAM-CTCAAAAATGGATCTTG-MGB。

1.2 試驗菌種與動物

干酪乳桿菌SY13：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院呂加平課題組分離自傳統(tǒng)乳制品；MRS培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)；大腸桿菌DH5α：天根生化科技有限公司；LB培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸粉，1%NaCl，pH7.4），200 μg/mL氨芐青霉素，37℃200 r/min搖床培養(yǎng)；BALB/c小鼠（SPF，維通利華），飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理平臺。

1.3 試驗方法

1.3.1 益生元篩選

以MRS培養(yǎng)基（蛋白胨1%，牛肉粉1%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，硫酸鎂0.01%，醋酸鈉0.5%，檸檬酸氨0.02%，磷酸氫二鉀0.02%，硫酸錳0.005%，吐溫80 0.1%）為基礎(chǔ)，用乳果糖、棉籽糖、低聚甘露糖、新瓊寡糖、低聚龍膽糖、大豆多糖、枸杞多糖、黃芪多糖、香菇多糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、β葡聚糖和水蘇糖分別替換葡萄糖，作為碳源，配制相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基。將干酪乳桿菌以1%的接種量分別接種于MRS和不同的篩選培養(yǎng)基中，取800 μL于24孔板中，進(jìn)行干酪乳桿菌SY13培養(yǎng)。以相應(yīng)空白培養(yǎng)基為對照，多功能酶標(biāo)儀測定OD600，繪制生長曲線。多功能酶標(biāo)儀試驗條件：溫度37℃；OD600測定，靜置培養(yǎng)58 min，200 r/min震蕩培養(yǎng)2 min，23個循環(huán)，測定OD600。

1.3.2 BALB/c小鼠試驗

96只6周～8周SPF級BALB/c雄性小鼠用于本試驗。小鼠自由采食與飲水，飼料與飲水均經(jīng)滅菌處理。給予7 d時間以適應(yīng)新環(huán)境后，相應(yīng)的隨機(jī)平均分組。分組及灌胃情況見表1。灌胃試驗完成后分別于第1、3、5、7 天處死小鼠，每次每組 3 只，取小鼠空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸，液氮保存。

表1 BALB/c小鼠分組及灌胃項Table 1 Details of groups of BALB/c mice and gavage items

1.3.3 基因提取

分別取小鼠1 cm空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸的內(nèi)容物，用糞便基因組DNA提取試劑盒提取基因組，提取方法參考說明書，洗脫體積是80 μL。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的提取應(yīng)用TIANprep Mini Plasmid Kit（DP103，TIANGEN），提取方法參考說明書，洗脫體積50 μL。

1.3.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，包括1 μL06232F（10 μmol/L），1 μL06232R（10 μmol/L），1 μL06232P（10 μmol/L），1 μL 模板 DNA，10 μL Taq－Man?Universal PCR Master Mix，6 μL 滅菌超純水。熒光定量PCR反應(yīng)條件包括：50℃酶激活2 min；95℃預(yù)變性10 min；循環(huán)階段，95℃變性15 s，58℃退火和延伸60 s，共40個循環(huán)；熒光檢測設(shè)定在退火和延伸階段。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

試驗的數(shù)據(jù)分析采用SPSS20，繪圖軟件采用Origin8.0。

2 試驗結(jié)果

2.1 益生元篩選

本研究以14種益生元為碳源進(jìn)行了干酪乳桿菌SY13生長試驗。低聚果糖和乳果糖作為碳源時生長狀況最優(yōu)，被選為后續(xù)研究對象。生長曲線見圖1。

圖1 SY13分別以14種益生元為碳源的生長曲線圖Fig.1 Growth curve of SY13 used 14 kinds of prebiotics as carbon source

2.2 外源性干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道分布分析

取AP1與AP2組第一天處死小鼠進(jìn)行熒光定量檢測，對比分析空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，試驗詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 單次灌胃下SY13在青年小鼠腸道分布Table 2 Regularities of distribution of SY13 with single oral administration in young mice

由表2可得出目標(biāo)菌在單次灌胃下，在腸道內(nèi)的分布規(guī)律。干酪乳桿菌SY13在盲腸和結(jié)腸中分布較多，空腸較少，回腸中未檢測到。其中盲腸比結(jié)腸更多一些，但是統(tǒng)計結(jié)果顯示差異性并不顯著。這與干酪乳桿菌ATCC393在腸道內(nèi)的分布相似[18]。

2.3 灌胃時間對SY13粘附力影響

取AP1與AP2、BP1與BP2組第一次處死小鼠進(jìn)行熒光定量檢測，分析空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，得出目標(biāo)菌在不同灌胃時間下，在腸道內(nèi)的分布規(guī)律。結(jié)果見表3。試驗結(jié)果表明，在青年小鼠中，灌胃時間對干酪乳桿菌在小鼠腸道內(nèi)的粘附能力有影響。隨著灌胃的進(jìn)行，一個月后，干酪乳桿菌SY13在小鼠回腸和盲腸內(nèi)的檢出數(shù)量顯著提高?？漳c有所提高，但是統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明并不顯著。這可能是干酪乳桿菌SY13長時間地入侵腸道，使腸道的微環(huán)境向有利于干酪乳桿菌SY13生長轉(zhuǎn)變。

表3 不同灌胃時間下SY13在青年小鼠腸道分布Table 3 Distribution of SY13 in intestinal tract with different gavage time to young mice

2.4 干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道保留時間分析

2.4.1 單次灌胃的干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道保留時間測定

取AP1與AP2組小鼠盲腸進(jìn)行熒光定量檢測，對比分析灌胃1、3、5 d和7 d的盲腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，得出目標(biāo)菌在單次灌胃下，在腸道內(nèi)的保留時間。試驗結(jié)果見圖2。

圖2 單次灌胃下的SY13在青年小鼠腸道內(nèi)的保留時間Fig.2 Retention time in intestinal tract of SY13 with single oral administration

由圖2可知，單次灌胃下，干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道內(nèi)僅能保留3 d。原因為干酪乳桿菌SY13與宿主BALB/c小鼠并非同源。非同源的宿主與益生菌并不容易發(fā)生粘附定植。

2.4.2 長時間灌胃的干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道保留時間測定

取BP1與BP2組小鼠盲腸進(jìn)行熒光定量檢測，對比分析灌胃1、3、5 d和7 d的盲腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，得出目標(biāo)菌在長時間灌胃下，在腸道內(nèi)的保留時間。試驗結(jié)果見圖3。

由圖3可知，長時間灌胃下，干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道內(nèi)能至少保留7 d，但是其在小鼠腸道內(nèi)沒有定植趨勢。隨著灌胃時間的推移，相對目標(biāo)菌在腸道內(nèi)的數(shù)量逐漸降低。這與單次灌胃下的試驗結(jié)論相一致：干酪乳桿菌SY13并不能在BALB/c小鼠腸道內(nèi)發(fā)生定植。但是保留時間的延長說明了干酪乳桿菌SY13對于宿主微生態(tài)產(chǎn)生了影響。

圖3 長時間灌胃下的SY13在青年小鼠腸道內(nèi)的保留時間Fig.3 Retention time in intestinal tract of SY13 in young mice with long time oral administration

2.5 益生元對SY13粘附屬性影響

2.5.1 益生元對SY13在BALB/c小鼠腸道粘附能力影響

取AP1、AP2、AP3和AP4組第1天處死小鼠進(jìn)行熒光定量檢測，試驗結(jié)果見表4。

表4 益生元作用下SY13在青年小鼠腸道分布Table 4 Distribution of SY13 gavage with prebiotics in intestinal tract of young mice

對比分析空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，得出目標(biāo)菌在單次灌胃下，在益生元作用下，腸道內(nèi)的分布規(guī)律。在益生元作用下，回腸明顯檢測到了目標(biāo)菌，但是其他腸段均無顯著性差異。單次灌胃下，益生元對SY13在BALB/c小鼠腸道粘附能力影響不大。

2.5.2 長期灌胃下益生元對干酪乳桿菌SY13在青年小鼠腸道粘附能力影響

取BP1、BP2、BP3和BP4組第一天處死小鼠進(jìn)行熒光定量檢測，對比分析空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，試驗結(jié)果見表5。

表5 益生元作用下長期灌胃的SY13在青年小鼠腸道分布Table 5 Distribution of SY13 long-term gavage with prebiotics in intestinal tract of young mice

由表5可得出目標(biāo)菌在長期灌胃后，在益生元作用下，在腸道內(nèi)的分布規(guī)律。試驗發(fā)現(xiàn)，在益生元作用下，干酪乳桿菌SY13在盲腸和結(jié)腸中的數(shù)量有所降低。空腸沒有明顯規(guī)律。干酪乳桿菌SY13在腸道內(nèi)的分布可能受腸道內(nèi)的流體基質(zhì)有關(guān)。在小腸中，其內(nèi)容物水分含量相對大腸較高，其流動性強(qiáng)于大腸腸內(nèi)容物。內(nèi)容物的流動性越強(qiáng)，則目標(biāo)菌越不容易在該腸段定植分布。低聚果糖和乳果糖在分子式中，都含有果糖。果糖能夠促進(jìn)宿主的腸道蠕動，利于宿主的糞便排除[19-22]。以至于雖然益生元有利于干酪乳桿菌生長，但短期內(nèi)并不利于其在宿主腸道內(nèi)定植。

2.5.3 單次灌胃下益生元對SY13在BALB/c小鼠腸道保留時間測定

取AP1、AP2、AP3和AP4組小鼠盲腸進(jìn)行熒光定量檢測，對比分析灌胃1、3、5 d和7 d的盲腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，得出在益生元作用下，目標(biāo)菌在單次灌胃時，在青年小鼠腸道內(nèi)的保留時間。試驗結(jié)果見圖4。

圖4 單次灌胃益生元和SY13下SY13在青年小鼠腸道保留時間Fig.4 Retention time of SY13 in young mice with single gavage with prebiotics

由圖4可知，單次灌胃下，無論有無益生元作用，干酪乳桿菌SY13在青年小鼠腸道內(nèi)僅能保留3 d。

2.5.4 長時間灌胃下益生元對SY13在BALB/c小鼠腸道保留時間測定

取BP1、BP2、BP3和BP4組小鼠盲腸進(jìn)行熒光定量檢測，對比分析灌胃1、3、5 d和7 d的盲腸內(nèi)目標(biāo)菌的數(shù)量，得出在益生元作用下，目標(biāo)菌在長期灌胃后，在青年小鼠腸道內(nèi)的保留時間。試驗結(jié)果見圖5。

圖5 長期灌胃益生元和SY13下SY13在青年小鼠腸道保留時間Fig.5 Retention time of SY13 in young mice with long-term gavage with prebiotics

由圖5可知，長期灌胃下，無論有無益生元作用，干酪乳桿菌SY13在青年小鼠腸道內(nèi)至少能保留7 d。并且由圖可知，低聚果糖曲線相對較陡，乳果糖曲線最為平緩，可得出結(jié)論：在青年小鼠腸道中，低聚果糖可能降低目標(biāo)菌的保留時間；乳果糖可能可以延長了目標(biāo)菌的保留時間。

3 結(jié)論

干酪乳桿菌SY13在BALB/c小鼠腸道中，主要分布于盲腸和結(jié)腸。宿主的年齡會影響其在腸道內(nèi)的定植，集中體現(xiàn)在回腸。隨著灌胃時間延長，灌胃次數(shù)的增多干酪乳桿菌SY13在腸道內(nèi)的數(shù)量會顯著增多。低聚果糖和乳果糖并不能夠在短期內(nèi)對干酪乳桿菌SY13在小鼠腸道內(nèi)的數(shù)量有影響；長期作用下，會略微降低目標(biāo)菌在腸段內(nèi)的數(shù)量，但可能會延長目標(biāo)菌在腸道內(nèi)的保留時間。本試驗的研究內(nèi)容為干酪乳桿菌SY13在功能性食品的研究與開發(fā)中提供了部分的理論依據(jù)。

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Adherence Property Resarch of Lactobacillus casei SY13 in Intestinal Tract of BALB/c Mice

JIA Zi-yang1，MA Chang-lu2，3，JIA Zhen-hu3，PANG Xiao-yang3，SUN Jian-feng1，*，Lü Jia-ping3，*
（1.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Heibei，China；2.Beijing Vocational College of Agrichuture，Beijing 102442，China；3.Institute of Food Science and Technology CAAS，Beijing 100193，China）

Lactobacillus casei possesses excellent beneficial function，and it is widely used in dairy products research and develop.This assay used real-time PCR to detect exogenous Lactobacillus casei SY13 in BALB/c mice，and assessed the distribution in intestinal tract and retention time.Time of gavage and prebiotics were explored the affect on adherence of Lactobacillus casei SY13.The experiment result indicated that gavaged Lactobacillus casei SY13 mainly distributed in cecum and colon；Aspects of gavage time and prebiotics both had effect on adherence of Lactobacillus casei SY13 in intestinal tract of BALB/c mice.

Lactobacillus casei SY13；BALB/c mice；gavage time；prebiotics；adherence

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.031

國家自然科學(xué)基金（31471603）；北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院科研項目（XY-YF-16-29）

賈子陽（1990—），男（漢），碩士，研究方向：乳酸桿菌益生作用。

*通信作者

2017-05-03