， ， ， (青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧 810016)

不同發(fā)育時(shí)期菊芋塊莖DNA提取效果比較研究

宋向陽，趙孟良，王麗慧，李莉
(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧 810016)

為篩選菊芋塊莖DNA提取的適宜生育時(shí)期，以“青芋1號”菊芋品種為試材，用改良CTAB法對不同發(fā)育時(shí)期菊芋塊莖DNA進(jìn)行提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及全波長分光光度計(jì)檢測總DNA的純度、濃度及質(zhì)量，選用4條ISSR引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明：不同發(fā)育時(shí)期提取菊芋塊莖DNA效果較好，DNA濃度呈現(xiàn)單峰曲線變化，峰值出現(xiàn)在第9周，與瓊脂糖凝膠電泳檢測呈現(xiàn)的亮度結(jié)果一致，PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，提取的DNA能夠滿足后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)的要求。

菊芋塊莖； 不同時(shí)期； DNA提?。?ISSR-PCR

菊芋(HelianthusTuberosusL.)又稱洋姜、鬼子姜，屬菊科(compositae)，向日葵屬(Helianthusannuus)多年生草本植物。菊芋適應(yīng)性很強(qiáng)，在我國分布廣泛。其富含果聚糖、氨基酸及維生素等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，同時(shí)在改善環(huán)境[2]與生物能源[3]等方面具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和發(fā)展前景。

DNA 提取質(zhì)量的好壞關(guān)系到后續(xù)分子生物學(xué)研究成功與否，提取過程中受到很多因素的影響，另外不同的提取方法、不同提取部位所獲得的DNA，其純度和產(chǎn)率也不同[4]。目前關(guān)于不同作物上提取DNA的研究很多，在大豆[5]、葡萄[6]、荷花[7]、黃瓜[8]等提取DNA效果的比較已有報(bào)道，本課題組前期對菊芋不同部位的DNA提取效果進(jìn)行了研究[9]，但針對菊芋塊莖不同發(fā)育時(shí)期DNA提取效果及質(zhì)量的研究未見報(bào)道。

本研究以不同發(fā)育時(shí)期的菊芋塊莖為對象，提取其DNA，對提取質(zhì)量和產(chǎn)率進(jìn)行分析，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以期為后續(xù)大規(guī)模提取高質(zhì)量的菊芋塊莖DNA提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

注：1～8分別為匍匐莖形成的第1周、第2周、第3周、第5周、第7周、第9周、第11周、第13周的塊莖照片。圖1 不同發(fā)育時(shí)期的菊芋塊莖

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料選用青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院自主選育的“青芋1號”菊芋品種。在2016年6月下旬菊芋塊莖匍匐莖形成后開始取樣，每周取樣1次，7月后每隔2周取樣1次。取樣時(shí)清水沖洗干凈，用錫箔紙包裹后放入液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)地概況

樣品種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝所3號試驗(yàn)田，該地區(qū)屬湟水流域灌區(qū)，土壤為栗鈣土，土壤有機(jī)質(zhì)含量20.28 g/kg， pH值8.12，土壤含全氮1.17 g/kg，全磷2.18 g/kg，全鉀22.5 g/kg，速效氮69.0 mg/kg，速效磷65 mg/kg，速效鉀229. 0 mg/kg。

1.3 DNA提取

參考趙孟良[10]的改良CTAB法。

1.4 DNA樣品檢測

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取2μL DNA與2μL 6×loading buffer混勻，于1.0%的BIO-PAD Power PACTMUniversal瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V，20 min，在BIO-RAD Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)中照相和分析。

1.4.2 分光光度計(jì)檢測

采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的TGEM Plus 全波長分光光度計(jì)分別測量A260/280、A260/230值以及DNA的濃度。

1.5 ISSR-PCR驗(yàn)證

采用趙孟良[10]篩選出的4條ISSR引物(序列見表1)，擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系，對提取的8個(gè)時(shí)期DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

表1 引物名稱及序列

引物名稱序列(5’?3’)Y=(C，T)Tm(℃) P03HVHTCCTCCTCCTCCTCC58 UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT53 UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC55 UBC844CTCTCTCTCTCT55

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取效果

由圖2可知，不同時(shí)期的菊芋塊莖均能成功提取出DNA，并且提取的DNA條帶亮度較高，無拖尾現(xiàn)象。其中以第9周提取的DNA條帶亮度最高，第2周的亮度最低。

注：M為λ/HindIII DNA Marker；1～8分別為匍匐莖形成的第1周、第2周、第3周、第5周、第7周、第9周、第11周、第13周。圖2 不同發(fā)育時(shí)期菊芋塊莖DNA的提取電泳圖

由表2與圖3可知，在塊莖發(fā)育的不同時(shí)期中，基因組DNA提取的純度各不相同，第1周、第5周、第7周和第9周提取的DNA A260/280值在1.80～2.00之間，說明這4個(gè)時(shí)期提取DNA純度較高；第2周、第3周、第11周、第13周提取DNA A260/280值低于1.80或高于2.00。另外，不同時(shí)期提取的DNA濃度也各不相同，在匍匐莖形成的第2周提取的濃度最低，為40.3 ng/g，第9周的濃度最高，為156.2 ng/g；從第7周至第9周中獲得的DNA濃度相近，均超過100 ng/g。

表2 不同發(fā)育時(shí)期提取菊芋塊莖DNA的全波長分光光度計(jì)檢測結(jié)果

指標(biāo)取樣周期第1周第2周第3周第5周第7周第9周第11周第13周A260/2801．871．562．191．831．871．972．162．19A260/2301．491．631．491．972．021．931．961．72DNA濃度(ng/g)42．540．358．4586．4138．6156．2124．192．8

注：M為DNA Marker DSTM 5000;1～8為不同時(shí)期的DNA；A、B、C、D依次為引物UBCP 03、 UBC 834、UBC 835、UBC 844。圖4 不同發(fā)育時(shí)期菊芋塊莖提取DNA的PCR擴(kuò)增圖譜

圖3 不同發(fā)育時(shí)期菊芋塊莖DNA的提取濃度圖

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

結(jié)果表明，不同時(shí)期提取的DNA模板對ISSR擴(kuò)增沒有明顯影響，DNA的純度都能達(dá)到擴(kuò)增的要求；選用的4條隨機(jī)引物均能擴(kuò)增出條帶，且條帶比較清晰，明亮。

3 討 論

菊芋塊莖中富含大量的果聚糖及其他多糖類化合物，由于多糖類物質(zhì)的理化性質(zhì)與DNA極其相似，因此很難將其分離干凈，對DNA的提取造成一定的困難。此外，多糖類物質(zhì)與DNA結(jié)合形成的膠狀物通過影響酶的活性嚴(yán)重影響分子生物學(xué)下游的研究工作[4]，隨著菊芋塊莖發(fā)育，其糖分含量及比例也隨之發(fā)生變化。

本研究在前人對不同部位DNA提取的對比基礎(chǔ)上，針對不同發(fā)育時(shí)期的塊莖進(jìn)行DNA提取對比研究。結(jié)果表明，針對不同發(fā)育時(shí)期的塊莖提取DNA，均能在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)出清晰明亮的條帶，在菊芋塊莖不同發(fā)育期提取的DNA并未受到影響。隨著匍匐莖的增大，塊莖的不斷形成，菊芋塊莖中的DNA濃度初期呈現(xiàn)S型曲線，但隨著塊莖的逐漸增大，總體呈現(xiàn)單峰曲線變化，在第9周提取的濃度最高，第2周的濃度最低，這可能與同時(shí)期菊芋塊莖中大量合成的多糖類物質(zhì)有關(guān)，從而影響了DNA提取過程中糖類物質(zhì)的剔除，導(dǎo)致提取的DNA濃度降低。

通過ISSR引物擴(kuò)增驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，DNA濃度對ISSR標(biāo)記的擴(kuò)增條帶較為清晰，說明塊莖提取的DNA的產(chǎn)率能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在引物擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)條帶缺失現(xiàn)象，且都在塊莖發(fā)育的初期階段，它們之間是否有關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。

[1]李莉.菊芋[M].青海人民出版社,2012.

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[3]Lili Li,Li Li,Yipeng Wang,et al.Biorefinery products from the inulin- containing crop Jerusalem artichoke[J].Biotechnology Letters,2013,35:471-477.

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[5]王桂華,余麗蕓,劉術(shù)閆,等.不同方法提取大豆基因組DNA的效果比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(26):10 418-10 419,10 429.

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Comparative Study on Extraction Effect of DNA From Different Periods ofHelianthustuberosusL.

SONGXiangyang,ZHAOMengliang,WANGLihui,LILi
(Qinghai University of Agriculture and Forestry Research，Qinghai Province Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology,Xining 810016，China)

For screening the suitable growth period of Jerusalem artichoke tuber for DNA extraction,the tubers of Qingyu No.1HelianthustuberosusL.were used as experimental materials,the DNA were extracted with modified CTAB method and examined with agarose gel electrophoresis.DNA purity and concentration were measured by full wavelength spectrophotometer.Chosen four ISSR primers,DNA extracted from different periods ofHelianthustuberosusL.were used as the templates for ISSR amplification.The results showed that the effect of DNA extraction from different development period of Jerusalem artichoke tuber are good,DNA concentration show unimodal curve,peak appears in the ninth week,with agarose gel electrophoresis test the brightness of the present results are consistent,PCR test results show that the extracted DNA could meet the requirements of subsequent related molecular biology.

HelianthustuberosusL.tuber; different periods; DNA extraction; ISSR-PCR

2017-01-10

青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(Sczdsys-2014-02)；青海省科技廳對外合作交流項(xiàng)目(2015-HZ-805)。

宋向陽 (1993—)，女，河南新鄉(xiāng)人；在讀碩士研究生，研究方向：園藝；E-mail：xiangyang_s7@163.com。

李 莉(1959—)，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜生理及遺傳育種研究；E-mail:yyslili@ 163. Com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.037

S 632.9

A

1001-4705(2017)07-0037-04