單曉楓 ， 康元環(huán) ， 吳同壘 ， 孫武文 ， 張冬星 ， 賈俊鵬 ， 劉艷輝 ， 錢愛東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點試驗室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 3.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院 ， 吉林 長春 130000)

細鱗魚殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的分離鑒定

單曉楓1， 康元環(huán)1， 吳同壘2， 孫武文1， 張冬星1， 賈俊鵬1， 劉艷輝3， 錢愛東1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點試驗室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 3.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院 ， 吉林 長春 130000)

為確定吉林省某漁場細鱗魚發(fā)病死亡的病因，本研究由瀕死的細鱗魚體內(nèi)分離出一株優(yōu)勢菌，經(jīng)動物回歸試驗，該菌株對細鱗魚具有致病性，將其命名為BRL-15。經(jīng)菌體、菌落形態(tài)，理化特性，16S rRNA基因序列分析，鑒定菌株BRL-15為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌株對所選抗菌藥物中絕大多數(shù)高度敏感。試驗結(jié)果為細鱗魚殺鮭氣單胞菌病的防治提供一定理論依據(jù)。

細鱗魚 ； 殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種 ； 分離鑒定 ； 藥敏試驗

細鱗魚隸屬于鮭形目、鮭科、細鱗魚屬，其生活在亞洲東北部，是一種冷水性魚類。我國只有一屬一種，主要分布在西北、東北和華北的某些河流中[1]。細鱗魚是國家二級保護水生野生動物，在魚類學(xué)與動物地理學(xué)上具有重要學(xué)術(shù)研究價值。此外，細鱗魚營養(yǎng)價值較高，還具有可以防止血栓生成、加快傷口愈合等藥用功能，而受到人們喜愛[2]。但是，由于人類活動范圍擴大、捕撈過度等原因，該魚已處于瀕臨滅絕的狀態(tài)。為了保護這一名貴的魚類資源，我國已在吉林省圖們江流域、黑龍江省牡丹江流域、陜西省秦嶺地區(qū)等地建立了細鱗魚自然保護區(qū)，并進行人工的規(guī)?；B(yǎng)殖[3]。

隨著細鱗魚馴養(yǎng)繁殖過程的深入，出現(xiàn)了各種疫病，制約了其發(fā)展。目前，已有報道的細鱗魚疾病包括腸炎病、爛鰓病、水霉病、三代蟲病等多種。2016年6月，吉林省延邊朝鮮族自治州某養(yǎng)殖場的細鱗魚體側(cè)及尾部出現(xiàn)膿腫，甚至形成潰瘍，并有部分死亡現(xiàn)象。試驗室從瀕死魚體內(nèi)分離出1株優(yōu)勢菌株，經(jīng)動物回歸試驗證實其有致病性，通過理化鑒定、16S rRNA基因序列分析確定其種屬，并對菌株進行了藥敏試驗。研究結(jié)果細鱗魚潰瘍病的防治提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 患病細鱗魚、健康細鱗魚，均取自吉林省延邊朝鮮族自治州某漁場；RS培養(yǎng)基，購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL-2 000 Marker,購自TaKaRa公司；微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片,購自杭州微生物試劑有限公司；其余均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 病原菌的分離純化 無菌操作，取瀕死細鱗魚的肝臟、心臟等組織，劃線接種于RS瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落，再次劃線培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落進行純培養(yǎng)，并對純化的細菌進行革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.3 動物回歸試驗 將純化的細菌用無菌PBS稀釋至1.55×108CFU/mL，以每尾0.2 mL的劑量腹腔注射感染健康細鱗魚，同時設(shè)置對照組，腹腔注射0.2 mL的無菌PBS，每組感染10尾。飼養(yǎng)水溫保持在20 ℃、并保證溶氧充足。持續(xù)觀察7 d，記錄細鱗魚發(fā)病死亡情況，并對病死魚進行細菌分離培養(yǎng)。

此外，采集自然發(fā)病的瀕死魚心臟、肝臟等組織，5倍量添加無菌PBS(1g∶5 mL)，進行組織研磨且反復(fù)凍融，12 000 r/min離心15 min取上清，上清液用0.22 μm濾膜過濾，濾液經(jīng)無菌檢驗后接種健康細鱗魚，感染劑量、方法與魚尾數(shù)同上。

1.4 生理生化鑒定 挑取分離株純培養(yǎng)物，接種于微量生化反應(yīng)管中，具體操作及結(jié)果判定標準見微量生化反應(yīng)管說明書。

1.5 16S rRNA基因擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析 熱裂解法提取病原菌分離株的基因組，并以此為模板，擴增16S rRNA基因序列，引物為16S rRNA通用引物：P1：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′、P2：5′- GTGTGACGGGCGGTGTGTA-3′，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min、30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收后由吉林省庫美生物科技有限公司測序。

測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLSAT比對相似性，并用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行比較分析。

1.6 藥敏試驗 藥敏試驗采用K-B紙片法，將病原菌活菌擴增，并將菌濃度調(diào)成1.5×107CFU/mL。取0.1 mL菌液涂布于TSA瓊脂平板，選取20種藥敏紙片，貼于上述平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，依據(jù)CLSI標準，對藥敏結(jié)果進行判定。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離及菌落菌體形態(tài) 從患病瀕死細鱗魚體內(nèi)分離出1株優(yōu)勢菌，命名為BRL-15。該菌在RS培養(yǎng)基上為圓形、邊緣整齊的黃色菌落。革蘭染色為革蘭陰性短桿菌、兩端鈍圓、單在或雙在(見中插彩版圖1)。

2.2 動物回歸試驗 將菌株BRL-15腹腔接種細鱗魚，在4 d內(nèi)全部發(fā)病死亡，對照組無異常。剖檢病死魚，其病理變化與自然病死魚相同，從其體內(nèi)也分離出與BRL-15菌落、菌體、理化特性相同的細菌。

將組織濾液接種細鱗魚，并未出現(xiàn)發(fā)病等現(xiàn)象，說明這次引起細鱗魚死亡的病原是細菌感染而非病毒。

2.3 理化鑒定結(jié)果 菌株BRL-15葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、半乳糖、ONPG、膽汁七葉苷、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原、氰化鉀生長等結(jié)果陽性；乳糖、阿拉伯糖、阿拉伯醇、木糖、山梨醇、肌醇、尿素、靛基質(zhì)、硫化氫、枸櫞酸鹽、運動性等結(jié)果為陰性；與《伯杰氏細菌鑒定手冊》比對，基本符合殺鮭氣單胞菌特性，初步判定其為殺鮭氣單胞菌。

2.4 16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴增菌株BRL-15的16S rRNA基因片段經(jīng)電泳檢測約1 400 bp(圖2)，測序結(jié)果顯示，該片段長1 403 bp，將基因序列進行同源性檢索，同時選取不同氣單胞菌種屬代表株及BRL-15菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示，菌株BRL-15 16S rRNA基因序列與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種同源性達99%以上。

綜合菌體、菌落形態(tài)，理化特性與16S rRNA基因序列分析結(jié)果顯示，菌株BRL-15為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

圖2 菌株BRL-15 16S rRNA PCR擴增結(jié)果

圖3 分離菌株BRL-15 16S rRNA基因序列發(fā)育進化樹

2.5 藥敏試驗 菌株對20種抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果表明，該菌株除對強力霉素、多黏霉素B中度敏感外，其余18種抗菌藥物均高度敏感(表1)。

3 討論

殺鮭氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，其下有5個亞種，分別是殺鮭亞種、無色亞種、殺日本鮭亞種、史氏亞種和溶果膠亞種[4]。該菌分布廣泛，可以引發(fā)多種水生動物發(fā)病，尤其是鮭科魚類更易感染，感染魚體會出現(xiàn)皮膚潰瘍等癥狀，嚴重者會引起死亡[5]。本研究從患潰瘍細鱗魚體內(nèi)分離出一株細菌即是殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種，該菌經(jīng)動物回歸試驗顯示，對細鱗魚具有致病性，并與自然發(fā)病者癥狀一致。此外，本研究對病魚組織進行了研磨、離心、取上清，并用此上清進行了攻毒試驗，結(jié)果顯示，細鱗魚并未發(fā)病。綜合以上試驗證明，此次細鱗魚潰瘍病的病原為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。而究其感染原因可能是發(fā)病前期當(dāng)?shù)貧鉁匕l(fā)生驟變、加上部分魚體受傷，致使魚機體免疫力下降，其自身攜帶的細菌感染導(dǎo)致發(fā)病，并迅速傳染同池細鱗魚，致使疾病暴發(fā)。

表1 分離菌株BRL-15的藥敏試驗結(jié)果

S：高度敏感；I：中度敏感

殺鮭氣單胞菌的5個亞種之間的理化特性區(qū)別不大[6]，為更準確的鑒定，本試驗通過PCR擴增出菌株BRL-15的16S rRNA基因序列，通過BLSAT的比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析：其與GenBank上公布的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種16S rRNA基因序列的同源性在99%以上，且系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株BRL-15與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種聚為一支。綜合菌落菌體形態(tài)、理化特性、16S rRNA基因序列分析，菌株BRL-15最終確定為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

目前，國內(nèi)魚類大部分細菌病的治療仍以抗生素為主，因此，為篩選合適的抗生素治療該病，本研究對菌株BRL-15進行了藥敏試驗。令人欣慰的是：菌株BRL-15對試驗所選的絕大部分藥物均比較敏感，這與異育銀鯽源、鯉魚源殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的耐藥性有一定區(qū)別[7-8]，與同樣為細鱗魚的病原菌殺鮭氣單胞菌無色亞種的耐藥譜也區(qū)別較大[1]。這可能與菌種不同、菌株來源地點不同有一定關(guān)聯(lián)。此外，本試驗所用細鱗魚所屬的養(yǎng)殖場為山泉流水養(yǎng)殖，水環(huán)境優(yōu)良、受到抗生素的污染較少，魚的抵抗力相對較強，而此次發(fā)病，如上所討論，可能是氣溫變化較為劇烈，加上換池導(dǎo)致的魚體受傷所致。因此，菌株BRL-15的藥敏試驗結(jié)果是對試驗所選絕大多數(shù)藥物敏感。

為防治細鱗魚潰瘍病的發(fā)生，除加強日常管理、盡量避免魚體受傷外，如果研制其病原的滅活疫苗或其他優(yōu)質(zhì)疫苗，則可以更好預(yù)防該病的發(fā)生，還可以減少抗生素的使用，進而降低耐藥菌株出現(xiàn)的風(fēng)險，減少食品中藥物殘留的危害。

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IsolationandidentificationofAeromonassalmonicidasubspSalmonicidafromBrachymystaxlenok

SHAN Xiao-feng1, KANG Yuan-huan1, WU Tong-lei2, SUN Wu-wen1, ZHANG Dong-xing1, JIA Jun-peng1, LIU Yan-hui3, QIAN Ai-dong1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China;2.Hebei Normal University of Science amp; Technology, Hebei Province Key laboratory of Veterinary Proventive Medicine, Qinhuangdao 066004,China; 3.Jilin Province Research Institute of fisheries science,Changchun 130000,China)

To identify the cause of disease from theBrachymystaxlenokin Jilin Province,the pathogenic strain was isolated from moribundBrachymystaxLenok. A purely cultured strain (BRL-15) causedBrachymystaxlenokinfected. It was identified asAeromonassalmonicidasubsp.salmonicidaaccording to its morphological, and physiobiochemical characteristics, and 16SrRNA sequencing. The result of drug susceptibility test showed that the isolatesensitive was to most antibiotics. These results provide a scientific basis for treatment ofBrachymystaxLenokinfected withAeromonassalmonicida.

BrachymystaxLenok;Aeromonassalmonicidasubsp ;Salmonicida; isolation and identification ; Drug resistance

s: QIAN Ai-dong ; LIU Yan-hui

S943.121

A

0529-6005(2017)10-0091-03

2017-03-04

國家自然科學(xué)基金項目(31201927)；吉林省重點科技攻關(guān)項目(20150204065NY)；吉林省科技廳自然基金項目(20170101016JC)

單曉楓(1977-)，男，副教授，博士，從事動物細菌學(xué)方面的研究，E-mail: sxf1997@163.com

錢愛東，E-mail: qianaidong0115@163.com；劉艷輝，E-mail: liuyanhui9@163. com