吳學(xué)敏 ， 陳秋勇 ， 陳如敬 ， 王隆柏 ， 車勇良 ， 王晨燕 ， 嚴(yán) 山 ， 劉玉濤 ， 周倫江

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 ， 福建 福州 350013)

仔豬大腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

吳學(xué)敏 ， 陳秋勇 ， 陳如敬 ， 王隆柏 ， 車勇良 ， 王晨燕 ， 嚴(yán) 山 ， 劉玉濤 ， 周倫江

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 ， 福建 福州 350013)

為了研究福建省閩北地區(qū)某豬場豬大腸桿菌的耐藥情況，通過采集32份發(fā)生仔豬黃、白痢的糞便，經(jīng)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再經(jīng)普通肉湯純培養(yǎng)，用鏡檢方法、PCR擴(kuò)增方法和生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果共分離到29株大腸桿菌。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，分解甘露醇、葡萄糖、乳糖和麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，V-P試驗(yàn)為陰性，M.R.試驗(yàn)呈陽性，硫化氫試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陽性，硝酸鹽試驗(yàn)陽性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的大部分菌株對四環(huán)素、林可霉素、先鋒霉素Ⅳ耐藥；大多數(shù)菌株對多黏菌素B、復(fù)方新諾明和痢特靈高度敏感。該研究為當(dāng)?shù)刎i場臨床用藥提供參考，為豬大腸桿菌病的預(yù)防控制提供理論依據(jù)。

大腸桿菌 ； 分離 ； 鑒定 ； 敏感性

大腸桿菌是自然界中一種最常見的革蘭陰性菌，普遍存在于環(huán)境中，在豬的腸道中與豬屬于共生情況。仔豬大腸桿菌性的腹瀉拉稀，即俗稱仔豬黃、白痢，是由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的高度接觸性、致死性傳染病。此類引起仔豬消化道疾病的致病性大腸桿菌，能產(chǎn)生許多種毒素引起仔豬發(fā)病，如腸毒素、內(nèi)毒素、神經(jīng)毒素和致水腫毒素等，其中腸毒素是造成腹瀉的主要因素。由于致病性大腸桿菌血清型的不同和豬的年齡、體質(zhì)、免疫狀態(tài)等差異，可分為仔豬黃痢、仔豬白痢。仔豬黃痢為小豬出生后1周齡內(nèi)所發(fā)生的，仔豬白痢為2～3周齡仔豬發(fā)生的腹瀉，均是豬場中最常見的傳染病，豬場一旦有發(fā)生就很難根除，發(fā)病小豬即使有耐過，也會嚴(yán)重影響仔豬的生長，因此給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)以福建省閩北地區(qū)某豬場的仔豬腹瀉為研究對象，對致病性大腸桿菌進(jìn)行分離、鑒定及藥物敏感性的研究分析，以期對當(dāng)?shù)刎i場大腸桿菌性腹瀉的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理 2017年2月福建省閩北地區(qū)某豬場哺乳仔豬發(fā)生黃、白痢，以高壓滅菌棉簽拭子，隨機(jī)采集32份正在患病哺乳仔豬的肛門試樣，于5 mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。

1.2 細(xì)菌分離純化 將初培養(yǎng)的菌液畫線接種麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落形態(tài)。并挑取單個紅色菌落接種于普通營養(yǎng)肉湯，37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。將擴(kuò)繁培養(yǎng)好的菌液4 ℃存放，用于PCR和生化試驗(yàn)鑒定及藥物敏感性分析。

1.3 PCR方法鑒定 針對大腸桿菌16S rRNA保守序列設(shè)計一對引物， 送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為328-F：5′-TGAAGCGACCTGCACTCATT-3′；328-R：5′-CGGGTCAGTGGCAAGGTTAT-3′。再進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化及特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)。PCR反應(yīng)總體積為25 μL：2×GoTaqMaster Green Mix 13.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，無菌去離子水補(bǔ)充至終體積為25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照觀察結(jié)果。

1.4 生化試驗(yàn) 將符合大腸桿菌形態(tài)特征及PCR鑒定為陽性的細(xì)菌，接種于生化試驗(yàn)微量發(fā)酵管(葡萄糖、棉子糖、甘露醇、尿素、枸櫞酸鹽、葡萄糖磷酸鹽、賴氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、半固體瓊脂、硫化氫、山梨醇、蛋白胨水、木糖、側(cè)金盞花醇)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 藥敏試驗(yàn) 用高壓滅菌的棉簽蘸取已鑒定好的豬大腸桿菌菌液，均勻涂布到肉湯瓊脂平板的表面。選取以下10種常用的抗生素:慶大霉素、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、多黏菌素B、丁胺卡那霉素、復(fù)方新諾明、先鋒霉素Ⅳ、痢特靈、林可霉素，貼到這些瓊脂平板的表面，37 ℃培養(yǎng)18 h后，觀察測量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果 初培養(yǎng)菌液畫線于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)的特征：形成紅色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大菌落；取培養(yǎng)物涂片進(jìn)行革蘭染色，鏡檢能見到革蘭陰性、兩端鈍圓的紅色短桿菌。此次從32個樣品中共分離到29株此類細(xì)菌。

2.2 PCR鑒定結(jié)果 將在麥康凱培養(yǎng)基上具有大腸桿菌生長特性的29株菌進(jìn)行PCR鑒定，提取的DNA為模板均能擴(kuò)增到約328 bp大小的條帶(如圖2所示)，將擴(kuò)增的產(chǎn)物送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果與網(wǎng)上公布的E.coli16S-rDNA序列同源性為100%～98.8%，可初步判定此次用仔豬肛門拭子分離到的29株菌均為大腸桿菌。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)

圖2 部分菌株的PCR結(jié)果

2.3 生化鑒定結(jié)果 將分離的29株細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，分解甘露醇、葡萄糖、乳糖和麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，絕大部分能分解阿拉伯糖，部分能分解蔗糖，V-P試驗(yàn)為陰性，M.R.試驗(yàn)呈陽性，硫化氫試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陽性，硝酸鹽試驗(yàn)陽性。生理生化試驗(yàn)結(jié)果(見表1)均符合大腸桿菌的特征。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對分離到的29株豬源大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性分析。藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑15.1～20 mm者為高度敏感；直徑 10.1～15 mm者為中度敏感；直徑在10 mm以下者為耐藥。試驗(yàn)結(jié)果顯示：大部分菌株對先鋒霉素Ⅳ(26/29)、林可霉素(27/29)、四環(huán)素(26/29)耐藥；部分菌株對丁胺卡那霉素(15/29)和強(qiáng)力霉素(16/29)中度敏感；絕大多數(shù)菌株對復(fù)方新諾明(25/29)、痢特靈(27/29)和多黏菌素B(26/29)高度敏感。部分菌株的藥敏結(jié)果如表2所示。

3 討論

仔豬黃、白痢主要是由致病性豬大腸桿菌引起的初生仔豬的一種急性、高致死性傳染病，感染發(fā)病對象主要是7日齡以內(nèi)仔豬，1～3日齡的仔豬一旦感染，發(fā)病率可達(dá)90%以上，發(fā)病死亡率為30%～70%，發(fā)病率隨日齡增長而降低，臨床典型癥狀為劇烈腹瀉、排黃色或者灰白色水樣糞便，帶有小氣泡及腥臭味，死亡原因以拉稀脫水死亡為主。

表1 部分菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

+：陽性；—：陰性；⊕：陽性并產(chǎn)酸、產(chǎn)氣

表2 部分菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

S：高度敏感；I：中度敏感；R：耐藥

2017年2月本試驗(yàn)研究通過福建省閩北地區(qū)某豬場哺乳仔豬發(fā)生黃、白痢，以高壓滅菌棉簽拭子，隨機(jī)采集32份正在患病哺乳仔豬的肛門試樣，從中分離到29株豬大腸桿菌。通過革蘭染色鏡檢為革蘭陰性菌，在麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)均符合大腸桿菌的生長特性，PCR結(jié)果和生化試驗(yàn)結(jié)果表明分離的29株菌株確為大腸桿菌。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，此次分離的大多數(shù)菌株對多黏菌素B、復(fù)方新諾明和痢特靈高度敏感；大部分菌株對四環(huán)素、林可霉素、先鋒霉素Ⅳ耐藥；部分菌株對丁胺卡那霉素和強(qiáng)力霉素中度敏感。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，由于用藥不規(guī)范、療程不當(dāng)?shù)纫蛩?，如長期使用同一類藥物，或者長期在飼料、飲水中加入預(yù)防性用藥，均可使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性[2-3]。在豬場中藥物的使用應(yīng)遵循以下原則：嚴(yán)格避免濫用抗菌藥、確定有效的劑量和療程；嚴(yán)格遵守抗菌藥物局部使用、預(yù)防應(yīng)用、飼料添加及聯(lián)合使用的相關(guān)原則；合理的分期輪換使用抗菌藥；根據(jù)細(xì)菌耐藥機(jī)制和抗菌藥結(jié)構(gòu)的關(guān)系，尋找中草藥來代替抗生素藥物；安排合理的疫苗免疫，代替對藥物保健的長期依賴[4-5]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)隨機(jī)采集32份正在患病哺乳仔豬的肛門拭樣，從中分離到29株豬大腸桿菌，可反應(yīng)該豬場仔豬拉稀主要病因?yàn)榇竽c桿菌引起。本研究中分離的大部分菌株對四環(huán)素、林可霉素、先鋒霉素Ⅳ耐藥；部分菌株對丁胺卡那霉素和強(qiáng)力霉素中度敏感；大多數(shù)菌株對多黏菌素B、復(fù)方新諾明和痢特靈高度敏感。本研究結(jié)果對當(dāng)?shù)刎i場臨床上正確、合理地選用抗菌藥物有一定參考意義。

[1] 沈莉萍,徐鋒,王建.上海地區(qū)豬源大腸桿菌血清型及其毒力因子分布調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2014,46(8):94-97.

[2] 馬長賓,陳文武,陳海軍,等．規(guī)?；i場仔豬源大腸桿菌血清型調(diào)查及耐藥性檢測[J].畜牧與獸醫(yī),2016,48(3):27-32.

[3] 李淑紅,王京仁,成鋼. 豬大腸桿菌和葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(8):195-198.

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[5] 萬喜太,楊多學(xué).仔豬大腸桿菌病綜合防治[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2005,35(1):28-29.

IsolationandIdentificationofEscherichiacolifromPigletsandAnalysisofDrugSensitivity

WU Xue-min , CHEN Qiu-yong , CHEN Ru-jing , WANG Long-bai , CHE Yong-liang , WANG Chen-yan , YAN Shan , LIU Yu-tao , ZHOU Lun-jiang

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agriculture Sciences Fujian Animal Disease Control Technology Development Center, Fuzhou 350013, China)

In order to study the resistance of pigEscherichiacoliin a pig farm in northern of Fujian Province, we collected feces samples of 32 piglets that had yellow and white diarrhea. The Samples were separated and cultivated by McCain，and cultured by ordinary broth. The results showed that 29 strains ofEscherichiacoliwere isolated by microscopic method, PCR amplification method and biochemical test. The results of biochemical tests showed that they decomposed mannitol, glucose, lactose and maltose, and produced acid and gas; VP test was negative; MR test was positive; cyanide sulfide test was negative; citrate test was negative; indole test was positive; nitrate test was positive. The results of drug allergy testing showed that most strains were resistant to tetracycline, lincomycin, and cephalosporin IV, and were highly sensitive to polymyxin B, cotrimoxazole and furazolidone. The results of the study provide a reference for the clinical use in pig farms, and provide the theoretical basis for the prevention and control of porcine colibacillosis.

Escherichiacoli; Isolation ; Identification ; Sensitivity

ZHOU Lun-jiang

R378.2+1

A

0529-6005(2017)10-0086-03

2017-05-12

福建省公益類科研院所專項(2015R1023-10)

吳學(xué)敏(1984-)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)閯游锪餍胁W(xué)，E-mail：wxm0593@126.com

周倫江，E-mail:lunjiang@163.com