巨金玲 ， 張洪波 ， 陳 剛 ， 康 明

(1.青海大學農(nóng)牧學院 ， 青海 西寧 810016 ； 2.青海省畜牧獸醫(yī)科學院 ， 青海 西寧 810016)

青海巨型住肉孢子蟲線粒體cox1基因的克隆及進化分析

巨金玲1， 張洪波2， 陳 剛1， 康 明1

(1.青海大學農(nóng)牧學院 ， 青海 西寧 810016 ； 2.青海省畜牧獸醫(yī)科學院 ， 青海 西寧 810016)

為了研究青海省巨型住肉孢子蟲線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基(cox1)基因部分序列(pcox1)的遺傳變異情況，并用pcox1序列構建巨型住肉孢子蟲與其他住肉孢子蟲的種群遺傳關系。利用PCR技術擴增巨型住肉孢子蟲的pcox1，將測序所獲序列進行比對，并進行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。結果顯示，所獲得的pcox1序列長度均為968 bp，與GenBank已公布的巨型住肉孢子蟲相似度為99.1% ～ 99.8%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，所有分離株與已知巨型住肉孢子蟲位于同一分支。巨型住肉孢子蟲pcox1序列種內(nèi)相對保守(0.2%～0.7%)，種間差異較大(6.8%～20.8%)，可用作種間遺傳變異研究的標記。

巨型住肉孢子蟲 ； 藏羊 ； 線粒體DNA ；cox1基因 ； 種系發(fā)育關系

住肉孢子蟲是一類細胞內(nèi)的寄生性原蟲，廣泛發(fā)現(xiàn)于爬行類、鳥類和包括猴、鯨、各種家畜在內(nèi)的哺乳動物，能引起家畜發(fā)熱、貧血、消瘦、共濟失調(diào)、母畜流產(chǎn)、嚴重者甚至死亡[1]。本屬蟲體的最后一代裂殖體進入橫紋肌或心肌發(fā)育為肉孢子蟲包囊[2]，肌肉因大量包囊的寄生而變色變性使肉品廢棄，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，曾在新疆、青海、甘肅等地報道的綿羊住肉孢子蟲感染率達90.7%～100%[3]。因此，準確鑒別住肉孢子蟲不僅具有重要的學術價值和意義，而且對住肉孢子蟲病的預防和控制也具有重要的意義。

傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定對住肉孢子蟲準確定種有一定的局限性，而利用分子遺傳標記，通過研究其種群變異性對寄生蟲進行分類鑒定，則能獲得更加滿意的結果。線粒體DNA分子量較小，結構較穩(wěn)定，在細胞中含量豐富，且無組織特異性；呈現(xiàn)嚴格的母系遺傳特性，在世代傳遞中不發(fā)生基因重組；具有較快的進化速率，約為單拷貝核基因的5～10倍，用作遺傳學分析靈敏度高[4-7]。其中線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基(cox1)基因作為線粒體基因中比較保守的基因，在寄生蟲的分類鑒定和群體遺傳方面，被認為是理想的遺傳標記[8-9]。本研究旨在分析青海藏羊巨型住肉孢子蟲線粒體cox1基因部分序列(pcox1)的遺傳變異情況，并用pcox1序列構建巨型住肉孢子蟲與其他住肉孢子蟲的種群遺傳進化樹，從而明確巨型住肉孢子蟲線粒體cox1基因能否成為理想的種間遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、6×DNA loading Buffer、2×TaqPCR MasterMix、ddH2O、5×TBE、核酸染料、DL-2 000 DNA Marker，均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 蟲體樣品 本試驗的10個巨型住肉孢子蟲樣品均采自青海西寧藏羊食道內(nèi)，為白色米粒狀蟲體，蟲體大小不一，經(jīng)形態(tài)學鑒定均為巨型住肉孢子蟲。

1.3 樣品DNA提取 將蟲體用雙蒸水反復吹打沖洗后置于1.5 mL滅菌離心管中，用勻漿機研磨蟲體，加入200 μL緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮，加入20 μL Proteinase K，混勻后于56 ℃電浴鍋消化3 h，消化好的蟲體懸液按天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒說明書提取蟲體DNA，DNA樣品于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因片段擴增及測序 根據(jù)參考文獻[10]，由華大基因科技服務有限公司合成引物，上游引物SF1：5'-ATGGCGTACAACAATCATAAAGAA-3'，下游引物SR4：5'-CCACACCTGTAGTACCDCC-3'。反應體系為50 μL：模板DNA 6 μL，上、下游引物各1 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，再加入ddH2O 17 μL，按下列條件進行PCR擴增：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外投射儀下觀察結果，用凝膠成像系統(tǒng)攝像。PCR產(chǎn)物切膠回收后，將回收產(chǎn)物與T載體連接、轉(zhuǎn)化、克隆后，將鑒定為陽性的菌液送至生物公司測序。

1.5 序列分析 將測序所得序列與 GenBank 中收錄的住肉孢子蟲cox1序列信息(見表1)進行比較分析，結合形態(tài)學鑒定定種。利用 Clustalx 1.83軟件對測定序列和同源序列在默認設置下進行比對，并對比對結果進行眼觀調(diào)整，將5′端和3′端剪輯對齊，導入GeneDoc軟件，生成多重序列對比圖，分析樣品的相似性及堿基位點變異。用DNASTAR中的MegAlign程序?qū)悠沸蛄屑癎enBank中已收錄的住肉孢子蟲pcox1序列進行分析，比較其相似性和差異性。

表1 不同住肉孢子蟲的cox1序列信息

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 選擇進化距離較遠的Toxoplasmagondii(龔地弓形蟲)作為外群，利用生物軟件MEGA5.1，以鄰接法(Neighbor-Joining)對pcox1序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用Bootstraping法(重復1 000次)對構建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行評估。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 10個樣品均成功擴增出約1 000 bp的條帶(圖1)，與預期大小相符，且無非特異性條帶，表明成功擴增出目的基因。

圖1 巨型住肉孢子蟲pco×1擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

M：DL-2 000 DNA Marker; 1-10:XN1-XN10; 11:陰性對照

2.2 測序結果及分析

2.2.1 10個樣品的pcox1堿基序列長度相同，均為968 bp，經(jīng)ClustalX軟件轉(zhuǎn)換格式后，導入GeneDoc軟件，分析顯示每個樣品cox1序列均小于8個堿基位點變異，序列高度相似。

2.2.2 樣本間序列相似性較高，為99.3%～100%，與GenBank收錄的巨型住肉孢子蟲基因序列(基因登錄號：KC209601.1)高度相似，相似度為99.1%～99.8%。而與其他住肉孢子蟲的相似性都在84.3%以下，種內(nèi)差異性(0.2%～0.7%)遠小于種間差異性(6.8%～20.8%)(圖2)。

圖2 住肉孢子蟲pcox1序列差異的成對比較(對角線以上為相似率，以下為差異率)

1-10：XN1-XN10；11-16：S.gigantea、S.cafferi、S.fusiformis、S.hirsuta、S.buffalonis、S.tuagulusi

2.3pcox1的系統(tǒng)發(fā)育分析 種系發(fā)育顯示：10個青海分離株具有高度相似性，與GenBank中已報道的巨型住肉孢子蟲(S.gigantea)位于同一分枝，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，并且青海分離株所屬分枝與其他住肉孢子蟲所屬分枝相隔較遠，使樣本得到了很好的鑒別。

圖3 以Toxoplasma gondii外群，用N-J法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

線粒體 DNA 由于其自身在結構和功能上具有諸多優(yōu)勢，已經(jīng)成為當前研究生物物種遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育的重要的分子標記之一。其中cox1基因是線粒體DNA中進化速率較快且相對保守的基因，本試驗選用線粒體cox1基因作為分子標記，對形態(tài)學鑒定為巨型住肉孢子蟲的蟲體進行了分子生物學的分析，這樣較大程度地保證了結果的準確性和客觀性。選用引物SF1和SR4擴增線粒體cox1基因片段，是因為這一片段已被證明具有種屬特異性[10]。試驗結果顯示，各青海分離株相應序列具有很高的相似性，堿基位點變異均小于8，與GenBank中已公布的巨型住肉孢子蟲有很高的相似性，相似性在99.1%～99.8%之間。而與其他住肉孢子蟲相應序列的相似性都在84.3%以下，青海分離株cox1基因序列種內(nèi)差異為0.2%～0.7%，種間差異為6.8%～20.8%，由于pcox1序列種內(nèi)相對保守，種間差異較大，故能為種間的遺傳變異提供遺傳標記，用于巨型住肉孢子蟲的鑒定，這一結論可從國外學者Gjerde, B對住肉孢子蟲cox1基因序列分析得出的結論獲得有力的支持[10]。

采用N-J法構建的進化樹顯示出10個青海分離株位于同一大分枝，與巨型住肉孢子蟲同在一個分支，而與其他住肉孢子蟲所屬分枝相隔較遠，且系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，再次很好地證明了研究結果中所確定的分類地位。綜合上述結果，確定所采青海藏羊住肉孢子蟲為巨型住肉孢子蟲(S.gigantea)。

試驗結果表明，巨型住肉孢子蟲線粒體cox1基因是比較保守的基因，適宜于種間及種下的分類鑒別和系統(tǒng)發(fā)育分析，可作為理想的種間分子遺傳標記用于巨型住肉孢子蟲的鑒定。試驗結果驗證了線粒體cox1基因在進化生物學研究中的可行性和可靠性，即通過線粒體cox1基因序列測定及分析可對易與該蟲種混淆的蟲體做出正確的分類與鑒別。同時試驗結果也為住肉孢子蟲的分子分類、群體遺傳和系統(tǒng)發(fā)生規(guī)律方面提供了一定的科學依據(jù)。

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Cloningandphylogeneticanalysisofmitochondrialcox1geneofSarcocystisgiganteaisolatesfromQinghaiProvince

JU Jin-ling1, ZHANG Hong-bo2, CHEN Gang1, KANG Ming1

(1.Department of Veterinary Medicine, Qinghai University, Xining 810016, China;2.Academy of Animal Husbandry and Veterinary Science in Qinghai province, Xining 810016, China)

The objectives of this study were to examine the sequence variation in the partial mitochondrial cytochrome coxidase subunit I gene (pcox1) amongSarcocystisgiganteain Qinghai Province, and to study the phylogenetic relationship amongSarcocystisof the other family. Thepcox1 was amplified by PCR, then aligned thepcox1 sequence, analyzed the sequence homology, and constructed the phylogenetic tree. The results showed that the length ofpcox1 sequence as 968bp,and the similarity withS.giganteaavailable in GenBank was 99.1% ～ 99.8%. The phylogenetic tree revealed that the Qinghai isolates and theS.giganteaavailable in GenBank were clustered in the same branch. There were no signification variation inpcox1 sequence withinS.gigantea(0.2% ～0.7%), while inter-species differences was obvious(6.8%～20.8%). It is concluded thatpcox1 sequence can be used as genetic marker for population genetic studies.

Sarcocystisgigantea; Tibetan sheep ; mitochondrial DNA ;cox1 gene ; phylogenetic relationship

KANG Ming

S852.72+3

A

0529-6005(2017)10-0006-04

2016-11-10

青海省農(nóng)牧廳科技專項(NMSY-2015-01)；國家自然科學基金(31660698)

巨金玲(1992-)，女，碩士，從事高原畜禽生理學研究，E-mail:545962186@qq.com

康明，E-mail：qhukang@163.com