曹杰 范成普★ 杜杭根 周冰之 王承 郝必烈

·論著·

托吡酯對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

曹杰 范成普★ 杜杭根 周冰之 王承 郝必烈

目的從神經(jīng)細(xì)胞凋亡角度探討托吡酯（TPM）對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后早期腦損傷（EBI）的神經(jīng)保護(hù)作用，從而為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法取140只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組（20只）、SAH模型組（30只）和SAH＋TPM干預(yù)組（90只平均分為3組，術(shù)后2h分別予TPM 20mg/kg、40mg/kg及80mg/kg腹腔注射）。利用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，對(duì)各組在制模后24h進(jìn)行死亡率統(tǒng)計(jì)和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，采用干濕重法檢測(cè)腦水腫指數(shù)，TUNEL/NeuN/DAPI/Merge熒光染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，Western blot法評(píng)估Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與假手術(shù)組比較，SAH模型組和各TPM干預(yù)組的死亡率和腦水腫指數(shù)上升，神經(jīng)學(xué)評(píng)分降低。與SAH模型組比較，3個(gè)TPM干預(yù)組的神經(jīng)學(xué)評(píng)分均上升，腦水腫指數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠SAH后24h，Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞增加。TPM干預(yù)后，Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目有所減少，且這種效應(yīng)與劑量呈正相關(guān)。結(jié)論TPM可能通過(guò)抑制Caspase-3、Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，從而減輕SAH后神經(jīng)元細(xì)胞繼發(fā)性凋亡損傷，在神經(jīng)功能保護(hù)方面具有積極作用。

托吡酯 蛛網(wǎng)膜下腔出血 早期腦損傷 細(xì)胞凋亡 凋亡相關(guān)蛋白

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）是指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，其死亡率高達(dá)50%，1/3的人預(yù)后不良[1]。SAH后早期腦損傷（EBI）是指SAH發(fā)病后72h內(nèi)產(chǎn)生的顱腦損傷，減輕SAH后EBI對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義，如在EBI期間聯(lián)用擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、平衡代謝和抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗血小板的藥物，能有效防治再出血、血管痙攣及腦水腫等并發(fā)癥，從而改善患者預(yù)后。托吡酯（TPM）除了抗癲癇作用，還具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，已在缺血缺氧性腦損傷等研究中得到證實(shí)[2]，但其在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷治療方面的應(yīng)用還缺乏相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康的成年雄性SD大鼠140只，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。術(shù)前置于空氣過(guò)濾的環(huán)境，保持溫濕度一致，自由獲取食物和水。

1.2 方法 （1）分組：140只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組（20只）、SAH模型組（30只）和SAH＋TPM干預(yù)組（90只平均分為3組，術(shù)后2h分別予TPM 20mg/kg、40mg/kg及80mg/kg腹腔注射）。（2）模型制作：頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型[3]：取實(shí)驗(yàn)用SD大鼠，用1%戊巴比妥鈉（50m/kg）腹腔注射麻醉后仰臥固定，右側(cè)股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血壓及動(dòng)脈血?dú)猓g(shù)前及蛛網(wǎng)膜下腔出血后各抽取一次動(dòng)脈血行血?dú)夥治?。固定頭部及四肢，頸前部備皮、消毒，取頸部正中切口，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）結(jié)扎切斷ECA和ICA之間的吻合支，將ECA結(jié)扎并切斷拉直，使其與ICA成一直線。取3.0單股尼龍線50mm（3號(hào)漁線）將頭端銳化，于線端18.5mm處作標(biāo)記，將尼龍線從頸外動(dòng)脈置入頸內(nèi)動(dòng)脈的顱內(nèi)段，插入深度為18.5mm左右，當(dāng)感覺(jué)有阻力時(shí)再前進(jìn)3mm刺破血管，造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，大約15s后迅速將尼龍線拔出，用絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，恢復(fù)血流，縫合頸部切口，術(shù)中維持肛溫37℃。假手術(shù)組除了不刺破血管壁外，其余操作均與SAH模型組一致。麻醉未清醒前給予電熱毯保暖，術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，注意保暖。（3）取腦固定方法：用2%戊巴比妥鈉（0.12ml/50g）腹腔注射麻醉后，迅速開(kāi)胸暴露心臟，灌注固定后取腦固定2～4h，分別置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至標(biāo)本沉底。冰凍切片機(jī)作連續(xù)冠狀切片，取海馬和齒狀回互包平面，片厚30μm。（4）給藥方式：TPM干預(yù)組于制模后2h，予不同劑量TPM腹腔注射（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg），假手術(shù)組和SAH模型組在同等條件下注射等量生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo) （1）死亡率和行為學(xué)分析：制模后24h為評(píng)估時(shí)間點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)大鼠死亡率，進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[4]，最低分3分，最高分18分。（2）腦組織水含量測(cè)定：各組大鼠制模后24h完成上述指標(biāo)統(tǒng)計(jì)后斷頭取腦，采用干、濕重法，取傷側(cè)大腦半球腦組織標(biāo)本，電子天平稱取濕重（溫度20℃～25℃，濕度70%～90%），然后將標(biāo)本置于（100±2）℃恒溫干燥箱內(nèi)24 h烘干至恒重，稱取干重，腦組織含水量＝（濕重-干重）/濕重×100%。（3）凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用TUNEL/NeuN/DAPI/Merge熒光染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，Western blot方法評(píng)估Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 死亡率、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織水腫指數(shù) 假手術(shù)組的大鼠未發(fā)生死亡，SAH模型組和各TPM干預(yù)組之間的死亡率無(wú)顯著差異。與假手術(shù)組比較，SAH能導(dǎo)致SAH模型組和各TPM干預(yù)組的神經(jīng)學(xué)評(píng)分降低，腦水腫指數(shù)增高，隨著TPM給藥劑量的增加，神經(jīng)學(xué)評(píng)分逐漸上升，腦水腫指數(shù)逐漸下降。與SAH模型組比較，經(jīng)TPM治療后，上述指標(biāo)均有不同程度改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中小劑量TPM減輕腦水腫作用不明顯，中等劑量和高劑量TPM對(duì)腦水腫有明顯的緩解作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 制模后24h各組大鼠死亡率、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦水腫指數(shù)（±s）

表1 制模后24h各組大鼠死亡率、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦水腫指數(shù)（±s）

注：與SAH模型組比，*P＜0.05，#P＜0.05；與TPM20mg/kg組腦水腫指數(shù)比較，▲P＜0.05

組別死亡率（%）神經(jīng)學(xué)評(píng)分（分）腦水腫指數(shù)（%）假手術(shù)組0（0/20）18.0±0.076.3±1.8 SAH模型組26.67（8/30）8.6±2.279.9±1.5 TPM20mg/kg30.00（9/30）9.4±0.7*79.9±1.7#TPM40mg/kg23.33（7/30）11.1±0.9*76.9±1.7#▲TPM80mg/kg26.67（8/30）11.5±0.8*76.9±1.8#▲

2.2 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 與假手術(shù)組比較，SAH模型組和各TPM干預(yù)組中可觀察到更高比例綠色標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，Caspase-3及Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)TPM治療后，綠色標(biāo)記的凋亡細(xì)胞比例隨著給藥劑量增加而逐漸下降，Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，且這種效應(yīng)與劑量呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 各組大鼠大腦皮層TUNEL/NeuN/DAPI/Merge熒光染色的代表性顯微照片

圖2 各組大鼠Caspase-3和Bax 、Bcl-2表達(dá)情況

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其致死和致殘的主要原因可能是早期腦損傷和腦血管痙攣[5]。近年來(lái)關(guān)于EBI的病理生理機(jī)制研究表明，SAH后發(fā)生的顱內(nèi)壓升高、腦血管痙攣、腦缺血—再灌注損傷、有氧呼吸抑制、血腦屏障破壞、腦組織水腫以及神經(jīng)元死亡共同導(dǎo)致了繼發(fā)性神經(jīng)功能受損[5-6]，這為SAH后EBI進(jìn)程提供了多個(gè)可能的干預(yù)靶點(diǎn)。Park等[7]發(fā)現(xiàn)，SAH后血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可以增加血腦屏障的通透性，進(jìn)而導(dǎo)致腦血管痙攣。Xi G等研究表明氧化應(yīng)激在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的發(fā)生中具有重要作用，可歸因于血紅蛋白的大量釋放及鐵離子超負(fù)荷[8]。氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起大量炎癥介質(zhì)釋放，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1等，炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以激活經(jīng)線粒體途徑細(xì)胞凋亡通路的開(kāi)放，多種細(xì)胞膜受體如TNFR、Fas、DR3-5由其相關(guān)配體激活，繼而活化Caspase前體蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。多個(gè)研究中心都可以檢測(cè)到SAH后線粒體途徑的Caspase-3活化[9]，所以抑制Caspase-3依賴的凋亡途徑可能有助于減輕大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷。

TPM又稱為妥泰，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)并用于臨床的一種新型抗癲癇藥，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為2，3，4，5-雙氧-1-甲基亞乙基-β-右旋-氨基硫磺吡喃果糖，即自然態(tài)單糖右旋果糖的硫化物。TPM的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與以下方面有關(guān)：（1）抑制Na+、Ca2+通道的過(guò)度活化，減輕線粒體內(nèi)Ca2+內(nèi)流，因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞損傷后Ca2+內(nèi)流可引起線粒體膜通透性增強(qiáng)進(jìn)而釋放一些酶如細(xì)胞色素C等，引發(fā)一系列細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。（2）抑制KA/AMPA型谷氨酸受體的作用，降低谷氨酸的興奮性毒性和氧化應(yīng)激的損傷。（3）增強(qiáng)γ-氨基丁酸（GABA）系統(tǒng)介導(dǎo)的突觸抑制作用，防止神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)。Alves等[10]通過(guò)微透析技術(shù)檢查腦外傷病例發(fā)現(xiàn)，TPM可以通過(guò)血腦屏障，在腦組織達(dá)到相應(yīng)濃度，降低腦組織Glu含量，并可作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)膜蛋白復(fù)合體的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，抑制腦組織內(nèi)Ca2+內(nèi)流，從而影響谷氨酸、GABA及AMPA等受體介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。研究者利用成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型研究發(fā)現(xiàn)：運(yùn)用TPM治療可明顯提高腦損傷后的神經(jīng)功能評(píng)分，縮小梗死體積，且治療結(jié)果與治療劑量呈正相關(guān)[11]。但目前TPM在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷治療方面的應(yīng)用尚缺乏相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SAH模型組大鼠的死亡率、腦水腫指數(shù)及凋亡細(xì)胞比例都明顯高于假手術(shù)組，而神經(jīng)學(xué)評(píng)分低于假手術(shù)組，經(jīng)TPM干預(yù)治療后，上述指標(biāo)都有不同程度的改善。TPM還能下調(diào)Caspase-3相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，使促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，初步顯示TPM具有潛在的減輕SAH后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用，且這種效應(yīng)隨著給藥劑量的加大而逐漸增強(qiáng)。然而，本研究尚存在諸多不足：（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中缺乏陽(yáng)性藥物對(duì)照組，難以凸顯TPM治療EBI的臨床價(jià)值及意義。（2）未觀察到TPM劑量的上限效應(yīng)，因此，更合適的干預(yù)劑量需要進(jìn)一步研究。（3）只選取了SAH后24h為評(píng)估時(shí)間點(diǎn)，未考慮藥物作用的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。這些問(wèn)題還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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ObjectiveTo explore the neuroprotective effect of topiramate on brain injury in rats after experimental subarachnoid hemorrhage from the perspective of neuronal apoptosis，so as to provide theoretical basis for clinical application.MethodsForty healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups：sham operation group（20 rats），SAH model group（30 rats）and SAH + TPM intervention group（90 rats were divided into 3 groups，2 hours after operation TPM 20mg/kg，40mg/kg and 80mg/kg intraperitoneal injection）. The model of mortality and neurobehavioral scores were made in each group at 24 h after model establishment. The brain edema index was measured by dry and wet weight method.TUNEL/NeuN/DAPI/Merge fl uorescence staining were used to observe the apoptosis of neurons. The expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax-related proteins was evaluated by Western blot.ResultsCompared with the sham group，the mortality and brain edema index of the SAH model group and each TPM intervention group was increased and the neurological score was decreased. Compared with SAH model group，the neurological scores of the three TPM intervention groups was increased and the brain edema index was decreased，the differences were statistically signi fi cant（P＜0.05）.After 24 hours of SAH，the expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax was up-regulated and the number of apoptotic cells were increased. After TPM intervention，the expression of Caspase-3 and pro-apoptotic protein Bax was decreased，the expression of Bcl-2 and the number of apoptotic cells were decreased，and the effect was positively correlated with the dose.ConclusionsTPM may promote the expression of Bcl-2 by inhibiting the expression of Caspase-3 and Bax，thereby reducing the secondary apoptosis of neurons after SAH，and has a positive effect on neurological function protection.

Topiramate Subarachnoid hemorrhage Early brain injury Apoptosis Apoptosis-related proteins

浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金資助項(xiàng)目（2015ZY20）；浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目資助項(xiàng)目（Y201636786）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（曹杰）310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（范成普 杜杭根周冰之 王承 郝必烈）

*通信作者