張子陽(yáng)，聶世昌，馬奇興

（重慶市永川區(qū)公安局刑警支隊(duì)，重慶 402160）

DNA檢案中混合拭子提取方法的優(yōu)化

張子陽(yáng)，聶世昌，馬奇興

（重慶市永川區(qū)公安局刑警支隊(duì)，重慶 402160）

法醫(yī)遺傳學(xué)；提取法；DNA提??；混合拭子

在強(qiáng)奸案中，陰道拭子作為犯罪證據(jù)，其重要性不可替代。通常精斑預(yù)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的陰道拭子檢材即為混合斑的拭子，分離檢驗(yàn)方法是采用差異裂解法（兩步法）先除去精子外的其他細(xì)胞DNA，保留精子DNA[1]，再通過(guò) DNA IQTMSystem提取精子 DNA，獲得純精子的DNA圖譜。但在實(shí)際操作中，混合斑中的陰道上皮細(xì)胞和精子DNA未作定量檢測(cè)，使用該方法提取精子DNA時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)女性DNA去除不干凈或精子DNA被消化完全的情況，所以對(duì)于此類檢驗(yàn)的消化時(shí)間最好設(shè)置梯度，避免達(dá)不到理想效果而重復(fù)操作。

在面對(duì)含有混合斑的陰道拭子檢材時(shí)，首先應(yīng)篩選出精斑預(yù)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性的檢材進(jìn)一步檢驗(yàn)。但在常規(guī)混合拭子DNA提取方法中，需要37℃過(guò)夜孵育才能獲得理想的效果，由此造成整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程需耗費(fèi)1～2d時(shí)間，貽誤時(shí)機(jī)。如何建立一種快速、簡(jiǎn)捷的混合拭子DNA提取方法，是基層檢驗(yàn)人員面臨的難題。本研究通過(guò)對(duì)常規(guī)混合拭子DNA提取方法的優(yōu)化，采用快速去除女性成分法與Chelex-100法相結(jié)合，縮短提取時(shí)間，為案件的比對(duì)、篩查、快速偵破提供了方向和強(qiáng)大支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本

某強(qiáng)奸案中的現(xiàn)場(chǎng)檢材：受害人陰道拭子，精斑預(yù)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

1.2 主要儀器和試劑

BSC-1000ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），9700型PCR儀、3500基因分析儀（美國(guó)AB公司）；Chelex?100（美國(guó) Bio-Rad 公司），AmpF?STR?IdentifilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 DNA提取

1.3.1 常規(guī)混合拭子DNA的提取方法[2]

剪取適量檢材，裝入1.5mL離心管中，加900μL TNE緩沖液37℃浸泡30min。然后加入100μL 10%SDS至終濃度1%，加10mg/mL蛋白酶K 10μL至終濃度100μg/mL，置于恒溫振蕩儀上37℃下以200×g振蕩過(guò)夜。

將檢材轉(zhuǎn)入底部有網(wǎng)孔的離心管中，并將該有網(wǎng)孔的離心管套入一個(gè)完好的離心管中，以6000×g離心5min。吸去上清液，沉淀物用TNE緩沖液重懸，離心漂洗3次，得到沉淀物。向沉淀物中加入DNA IQTMSystem 試劑盒裂解液［100 μL 裂解液+1 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）］，95 ℃保溫 30 min；將上述裂解混合液離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；加入7μL磁珠，旋渦振蕩使磁珠懸浮，置搖勻儀上15min。再將離心管放在磁架上，小心吸去液體，用100μL洗滌液洗滌2次，無(wú)水乙醇洗滌1次，每次均旋渦振蕩使磁珠充分懸浮。洗滌完畢后，打開(kāi)離心管蓋子，室溫下空氣干燥5～10 min，加入30 μL（或適量）的超純水，蓋好蓋子，65℃加熱5min。取出離心管，立即旋渦振蕩離心管，使磁珠懸浮后放回磁架上。小心將DNA溶液吸出至干凈管中作為樣本1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 優(yōu)化混合拭子消化方法

分別剪取適量檢材于兩個(gè)1.5 mL離心管中，加入1 mL消化液［2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），200 μg/mL 蛋白酶 K，TNE 緩沖液］，56℃下以300×g分別振蕩孵育1 h和2 h，標(biāo)記為樣本2和樣本3。

將樣本2和樣本3以15000×g離心3min，去除上清液，1mL純水洗滌2次，去除上清液后加入100μL Chelex?100和1%蛋白酶 K，56℃水浴30 min；恒溫加熱器上100℃裂解10min，以15000×g離心3min，備用。

1.4 DNA擴(kuò)增和檢驗(yàn)

在配制的PCR反應(yīng)混合液8μL（反應(yīng)液4μL、引物 2 μL、純水 2 μL）中加入樣本 2 μL，再將反應(yīng)管放入9700型PCR儀中，按常規(guī)程序運(yùn)行：95℃ 11min；94℃ 20 s，59℃ 2 min，72℃ 1 min，28 個(gè)循環(huán)；60℃10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

樣本1按照常規(guī)混合拭子DNA的提取方法，檢驗(yàn)獲得一男性DNA圖譜（圖1）。

樣本2按照混合拭子優(yōu)化提取方法消化1 h，檢驗(yàn)獲得一混合DNA圖譜（圖2）。由圖2可以看出，其中含有女性成分，即1 h消化時(shí)間，女性成分消化不完全。

樣本3按照混合拭子優(yōu)化提取方法消化2 h，檢驗(yàn)獲得一男性DNA圖譜（圖3）。由圖3可以看出，采用混合拭子優(yōu)化提取方法消化2 h后檢驗(yàn)獲得的圖譜與按照常規(guī)混合拭子DNA的提取方法檢驗(yàn)獲得的圖譜效果一致。

圖1 樣本1 DNA圖譜

圖2 樣本2混合DNA圖譜

圖3 樣本3 DNA圖譜

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用差異裂解法（兩步法）對(duì)混合斑進(jìn)行分離檢驗(yàn)。其原理為精子細(xì)胞膜及核膜含有豐富的二硫鍵，對(duì)SDS及蛋白酶K有較強(qiáng)抵抗作用，而DTT等巰基試劑可使其裂解。除毛干、指甲外的非精子細(xì)胞沒(méi)有這一特性。因此利用女性上皮細(xì)胞與精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的差異，首先在蛋白酶K和SDS作用下裂解上皮細(xì)胞，分離去除上清液（女性DNA）、保留沉淀（精子的頭部），漂洗去除殘留的女性DNA；再在DTT和蛋白酶K存在的情況下，進(jìn)行二次裂解，釋放出精子DNA。

混合拭子優(yōu)化提取法與常規(guī)混合拭子DNA的提取方法主要區(qū)別在于消化條件的變化：消化液中的SDS由1%提高至2%，蛋白酶K濃度由100μg/mL提高至200μg/mL，同時(shí)孵育溫度由37℃提高至56℃，振蕩離心力由200×g提升至300×g，使其加速了女性DNA成分的完全裂解及消化。在操作上，檢材消化后直接離心即可使男性精子成分與檢材一起置于離心管的下層，達(dá)到分離的目的。同時(shí)只需采用Chelex-100法就能在高溫下粗提精子DNA，省去了DNA IQTMSystem提取時(shí)的繁瑣步驟，縮短了提取時(shí)間。

為了建立一種有效的混合拭子DNA提取方法，李鑫等[3]利用單細(xì)胞捕獲法、邵武等[4]利用過(guò)濾膜法分離精子細(xì)胞均在分離混合斑中取得了良好效果，但其提取時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備要求高，無(wú)法廣泛應(yīng)用。2014年，韓海軍等[5]利用改良差異裂解法結(jié)合硅珠法提取混合斑精子DNA，將提取時(shí)間縮短到6 h左右，但獲得單一男性DNA成功率在75%左右，且操作繁瑣。而采用該方法，無(wú)須增加設(shè)備即可將檢材的整個(gè)提取時(shí)間縮短至3h，節(jié)省了物力、人力及時(shí)間，操作簡(jiǎn)便。同時(shí)在對(duì)其他多件強(qiáng)奸案中的陰道拭子檢驗(yàn)，也獲得了理想的圖譜，均證明了該方法在基層一線實(shí)戰(zhàn)部門(mén)應(yīng)用的可行性和有效性。

作為一種快速提取分離的方法，由于沒(méi)有檢驗(yàn)更長(zhǎng)消化時(shí)間的樣本，故當(dāng)消化時(shí)間達(dá)到2 h以上，是否會(huì)導(dǎo)致精子DNA也消化完全，暫時(shí)沒(méi)有檢驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。受設(shè)備和樣本條件的限制，也無(wú)法對(duì)樣本進(jìn)行定量和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，本方法是否適用于所有混合斑樣本仍需深入研究。但在實(shí)際檢案中，可以通過(guò)設(shè)置消化時(shí)間梯度，以保證獲得最佳實(shí)驗(yàn)圖譜，同時(shí)在提取過(guò)程中需要注意：（1）檢材用量以管內(nèi)體積1/10為宜，以便于充分浸泡、裂解，并避免DNA模板濃度過(guò)高，導(dǎo)致小片段優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增。（2）若樣品在加入裂解液后仍呈黏稠狀，會(huì)影響后續(xù)檢驗(yàn)效果，此時(shí)應(yīng)使用裂解液進(jìn)一步稀釋。（3）在每一步均應(yīng)旋渦振蕩充分，洗滌充分，并盡量吸凈液體。（4）尤其注意觀察棉簽，如女性成分過(guò)多，應(yīng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，增加漂洗次數(shù)；遇有抑制物干擾或則雜質(zhì)較多時(shí)，還需通過(guò)稀釋或以DNA IQ系統(tǒng)純化法純化模板DNA來(lái)解決。

[1]GILL P， JEFFREYS A J， WERRETT D J.Forensic application of DNA ‘fingerprints’[J].Nature，1985，318（6046）：577-579.

[2]裴黎.現(xiàn)代DNA分析技術(shù)理論與方法[M].北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2002：168-176.

[3]李鑫，胡蘭，馮雪飛，等.混合斑中精子細(xì)胞分離及其DNA 制備方法[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（4）：286-289.

[4]邵武，姜先華，孫學(xué)科，等.精子富集柱分離技術(shù)的研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（3）：194-196.

[5]韓海軍，張玉紅，楊敏，等.改良差異裂解法結(jié)合硅珠法提取混合斑精子 DNA[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（1）：50-51，54.

2016-03-17）

（本文編輯：邊英男）

DF795.2

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10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.021

1004-5619（2017）05-0540-03

張子陽(yáng)（1982—），男，主檢法醫(yī)師，主要從事 DNA檢驗(yàn)鑒定及分析；E-mail：327165777@qq.com