熊東彥，李志遠(yuǎn)，黃丹，慕昕

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

關(guān)于NgAgo-gDNA與CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯中脫靶問題及穩(wěn)定性的分析

熊東彥，李志遠(yuǎn)，黃丹，慕昕

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

自CRISPR/Cas9技術(shù)被報(bào)道后，2016-05，韓春雨在自然雜志上發(fā)表了NgAgo-gDNA技術(shù)的成果，他宣稱，該技術(shù)更優(yōu)于CRISPR/Cas9。通過比較2種基因編輯技術(shù)的原理，針對(duì)2種技術(shù)在基因編輯過程中的脫靶問題以及穩(wěn)定性進(jìn)行分析，論證了NgAgo-gDNA技術(shù)能夠有效降低基因編輯中的脫靶率，并且gDNA比gRNA更具有穩(wěn)定性。最后利用自身的知識(shí)對(duì)NgAgo-gDNA技術(shù)無法重復(fù)的原因進(jìn)行分析，找出該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于獲得穩(wěn)定的5＇磷酸化ssDNA，并闡述了自己對(duì)韓春雨被質(zhì)疑事件的看法。

基因編輯技術(shù)；NgAgo-gDNA；CRISPR/Cas9；脫靶

2013-02，SCIENCE報(bào)道了張峰等的文章中關(guān)于CRISPR/Cas9（后簡稱“Cas9技術(shù)”）基因敲除新技術(shù)的內(nèi)容，隨后各國生物學(xué)家快速加入到Cas9技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用的研究中。但是，隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，Cas9技術(shù)在進(jìn)行基因編輯時(shí)，對(duì)目的基因的靶向特異性不強(qiáng)。不過，總體上來講，Cas9對(duì)于基因的敲除效率相較于之前的RNAi已經(jīng)顯著提升。2016-05-02，Nature報(bào)道了韓春雨等發(fā)明的DNA指導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)NgAgo-gDNA（后簡稱“gDNA技術(shù)”），在韓春雨的文章中，他指出gDNA技術(shù)是一種優(yōu)越于Cas9的技術(shù)[1]，它不僅能有效地對(duì)目的基因進(jìn)行編輯，還能將Cas9中存在的脫靶效應(yīng)的出現(xiàn)率降到最低[2]。

1 2種基因編輯技術(shù)的原理介紹

1.1 Cas9技術(shù)的原理

CRISPR技術(shù)源于1987年日本大阪大學(xué)在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶基因的研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas體系[5]，Cas9是這類體系中最具效率的體系。在這一體統(tǒng)中，crRNA通過堿基配對(duì)與tracrRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，此二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)切斷雙鏈DNA[3]。所以該技術(shù)是一種由RNA所引導(dǎo)的DNA編輯技術(shù)，現(xiàn)在我們用的Cas9技術(shù)工具只有Cas9核酸酶gRNA兩部分。利用該工具，我們可以非常方便地進(jìn)行基因的任意編輯改造，比如基因敲除、敲入或定點(diǎn)突變等。

1.2 gDNA技術(shù)的原理

gDNA技術(shù)源于荷蘭學(xué)者發(fā)現(xiàn)格氏嗜鹽桿菌的Ago蛋白可以有效地利用5＇磷酸化的單鏈DNA作為gDNA，對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割造成其雙鏈斷裂。具體來說，gDNA技術(shù)使用了5＇端磷酸化的單鏈DNA（簡稱“gDNA”）指導(dǎo)AGO蛋白切割，gDNA通過與目標(biāo)基因進(jìn)行特異性結(jié)合，引導(dǎo)AGO蛋白結(jié)合于該基因上，切割DNA。切割完成后，利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制完成DNA修復(fù)，最終達(dá)到對(duì)目的基因的編輯。所以，gDNA技術(shù)是一種由單鏈DNA引導(dǎo)DNA進(jìn)行基因編輯的技術(shù)。

2 2種技術(shù)在脫靶問題中的比較

哈佛大學(xué)David在Nature雜志發(fā)表了他們實(shí)驗(yàn)室利用體外篩選和高通量測(cè)序檢測(cè)Cas9技術(shù)的脫靶存在較高脫靶現(xiàn)象。韓春雨在其論文中指出，他的科研組發(fā)明的技術(shù)能夠大大改善基因編輯中的脫靶問題。

Cas9技術(shù)成功與否的關(guān)鍵問題在于gRNA的設(shè)計(jì)，gRNA和非目標(biāo)區(qū)域過多的非特異性結(jié)果，脫靶效率較高，特別是靠近PAM位點(diǎn)的8～10 bp不能和非目的區(qū)有高同源性[5]。因?yàn)間RNA本身的序列較短，通常為19 bp，所以其本身的特異性不高。而實(shí)驗(yàn)中，為了降低脫靶效率，經(jīng)常使用2個(gè)gRNA作為向?qū)?，共同引?dǎo)Cas9酶與目標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合。然而，加入2個(gè)gRNA后，基因編輯的效率又降低。而gDNA技術(shù)在gDNA的設(shè)計(jì)上相對(duì)于gRNA具有明顯的優(yōu)勢(shì)，首先gDNA的長度為24 bp，比gRNA多出5 bp，這樣可以大大提升gDNA的特異性識(shí)別效率，理論上gDNA技術(shù)對(duì)基因編輯的精確率可以提高45倍。另外，5＇端磷酸化的gDNA在哺乳動(dòng)物中本身不存在，這保證了NgAgo不會(huì)被內(nèi)源的DNA序列誤導(dǎo)至靶向錯(cuò)誤的基因組位點(diǎn)。同時(shí)，gDNA一旦與NgAgo結(jié)合，就不允許其他DNA片段插進(jìn)來替換，這又從另一方面保證了不脫靶。所以綜上所述，gDNA技術(shù)在理論上較Cas9技術(shù)在基因編輯中更能夠降低脫靶率，提高基因編輯的精確性。

3 2種技術(shù)在基因編輯中穩(wěn)定性的比較

所謂“穩(wěn)定性”，即指在基因編輯中，導(dǎo)向DNA或RNA、作用蛋白等能否持續(xù)有效地維持其活性完成整個(gè)編輯過程。Cas9系統(tǒng)中的sgRNA需要由質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞并表達(dá)，而后形成一定特殊結(jié)構(gòu)才能工作，可控性很差。gDNA系統(tǒng)中的gDNA直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞，時(shí)間和濃度較Cas9系統(tǒng)更可控，但是，NgAgo酶依然要通過表達(dá)載體導(dǎo)入，其表達(dá)效率等問題依然存在。gDNA理論上不會(huì)產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，gDNA系統(tǒng)在富含GC堿基區(qū)域部分的穩(wěn)定性的確比Cas9高。在實(shí)際反應(yīng)過程中，sgRNA與DNA結(jié)合后可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的其他生物化學(xué)過程影響DNA的結(jié)構(gòu)，從而使sgRNA從DNA上脫離。而gDNA在與DNA結(jié)合后能夠防止其他DNA的插入替換，可以提升編輯過程中的穩(wěn)定性。

4 對(duì)各界質(zhì)疑韓春雨技術(shù)的看法

現(xiàn)在，關(guān)于韓春雨等人的gDNA技術(shù)無法重復(fù)的事件鬧得沸沸揚(yáng)揚(yáng)。2016-07-30，國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)原主席Lluis向協(xié)會(huì)會(huì)員發(fā)信稱，NgAgo在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯中不起作用，建議停止驗(yàn)證韓春雨的實(shí)驗(yàn)。從各界的質(zhì)疑中，我們看出韓春雨的gDNA技術(shù)存在某些沒有完善的問題。在理論上，gDNA技術(shù)相較于Cas9技術(shù)的確具有更高的基因編輯效率，但在實(shí)際的操作中，gDNA技術(shù)因其極難重復(fù)而一直被質(zhì)疑。

在此，筆者認(rèn)為重復(fù)出韓春雨的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵點(diǎn)在于獲得5＇磷酸化的ssDNA，所以，能夠正確合成穩(wěn)定的5＇磷酸化的ssDNA并成功導(dǎo)入受體細(xì)胞并穩(wěn)定存在是該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的難題。在丁香園論壇中看到有人報(bào)道，在討論NgAgo的谷歌討論小組中，一名無法證實(shí)身份的研究者“Jan Winter”表示，他因?yàn)樘鎿Q了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)材料，取得了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的成功。結(jié)合之前的記者采訪，國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)的投票選擇，我們還是可以看出韓春雨的實(shí)驗(yàn)存在真實(shí)性。所以我們應(yīng)該給予韓春雨及其科研組充分的時(shí)間，讓他們找出實(shí)驗(yàn)中可改善的地方。對(duì)待科研，需要秉持懷疑心，也需要有足夠的耐心與毅力去探究科研中的種種問題。

5 結(jié)論

從理論上分析，gDNA技術(shù)因其gDNA的長度比gRNA長，可以大大提高gDNA的特異性識(shí)別效率，所以能夠較CRISPR/Cas9技術(shù)有效降低基因編輯過程中的脫靶率；gDNA技術(shù)極難重復(fù)的關(guān)鍵原因在于很難獲得能夠穩(wěn)定導(dǎo)入細(xì)胞并存在的5＇磷酸化ssDNA。

［1］孫瑜，蔡小寧，陳德富，等.NgAgo-gDNA基因組編輯系統(tǒng)的成功及啟示［J］.生物信息學(xué)，2016（03）：167-172.

［2］楊潔，曹玉錦.新一代基因組編輯技術(shù)——NgAgo-gDNA［J］.生物學(xué)教學(xué)，2016（11）：75.

［3］沈彬.利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯［D］.南京：南京大學(xué)，2014.

［4］吳金青，梅瑰，劉志國.應(yīng)用SSA報(bào)告載體提高ZFN和CRISPR/Cas9對(duì)豬IGF2基因的打靶效率［J］.遺傳，2015（01）：55-62.

［5］方銳，暢飛，孫照霖.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2013（08）：691-702.

〔編輯：劉曉芳〕

Q789

：A

10.15913/j.cnki.kjycx.2017.15.005

2095-6835（2017）15-0005-02

熊東彥，就讀于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，研究方向?yàn)樯镄畔W(xué)。