勵(lì) 炯,孫 嵐,王紅青,邱紅鈺,康 健
(1.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江 杭州 310017;2.島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司,上海 200052)
分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的5種硝基咪唑類藥物殘留
勵(lì) 炯1*,孫 嵐1,王紅青1,邱紅鈺1,康 健2
(1.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江 杭州 310017;2.島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司,上海 200052)
建立了水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)含0.1%氨水乙腈提取,加無水硫酸鈉、C18-N以及NH2-PSA凈化劑后渦旋振蕩對樣品進(jìn)行凈化,以Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 mm×100 mm)色譜柱分離,甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫,正離子模式電噴霧電離,配合多反應(yīng)離子掃描(MRM)定性定量分析目標(biāo)化合物??疾炝颂崛┲邪彼蛢艋瘎┑挠昧繉訕?biāo)回收率的影響,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,5種硝基咪唑類藥物在20~500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2≥0.998 9;3個(gè)加標(biāo)水平下的方法回收率為77.2%~94.8%;定量下限為0.7~2.0 μg/kg。該方法快速、簡單、準(zhǔn)確,適用于水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類藥物殘留的檢測。
高效液相色譜;串聯(lián)質(zhì)譜;分散固相萃取;硝基咪唑;水產(chǎn)品
硝基咪唑類藥物(Nitromidazoles,NMZs)是一種具有5-硝基取代咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1),常見的主要有甲硝唑(Metronidazole,MNZ)、地美硝唑(Dimetridazole,DMZ)、洛美硝唑(Ronidazole,RNZ)等[1]。NMZs具有抗菌和抗原蟲作用,在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用于寄生蟲的防治與感染[2-3]。但由于NMZs含有的硝基雜環(huán)類化合物具有細(xì)胞誘變性,并且經(jīng)生物體內(nèi)代謝后形成的羥基甲硝唑(MNZOH,MNZ 的代謝物) 和羥基二甲硝咪唑(HMMNI,DMZ 和RNZ 的共同代謝物)同樣具有原藥類似毒性,其殘留對動(dòng)物源性食品安全構(gòu)成了直接威脅,許多國家和地區(qū)已禁止該類藥物用于食源性動(dòng)物,我國也于2002 年禁用了該類藥物[4-6]。
圖1 MNZ、DMZ、RNZ、MNZOH和HMMNI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of MNZ,DMZ,RNZ,MNZOH and HMMNI
目前國內(nèi)外用于硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)[7-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[13-15]等。HPLC 法靈敏度低,易被雜質(zhì)干擾,且無法準(zhǔn)確進(jìn)行定性;GC-MS方法繁瑣,干擾因素多,適用范圍有限;而LC-MS/MS 兼具靈敏度高及抗干擾性強(qiáng)的優(yōu)勢,廣泛應(yīng)用于硝基咪唑類藥物多殘留的檢測。
前處理作為關(guān)鍵技術(shù),直接影響方法靈敏度和精密度。液質(zhì)聯(lián)用前處理方法多以乙酸乙酯提取為主,用小柱凈化,但其成本高、耗時(shí)長、步驟繁瑣,操作不當(dāng)易造成損失而影響定量準(zhǔn)確性。本研究建立了分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的方法,采用分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行前處理,省去了濃縮、固相小柱萃取等步驟,具有靈敏、簡便、高效的優(yōu)點(diǎn),可滿足水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測需求。
1.1 儀器與試劑
美國Agilent公司高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6410串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司),MS3旋渦混合器。
甲硝唑(MNZ)對照品(批號(hào):106700,Dr.Ehrenstorfer GmbH,含量99.8%);洛硝噠唑(RNZ)對照品(批號(hào):101507,Dr.Ehrenstorfer GmbH,含量99.0%);地美硝唑(DMZ)對照品(批號(hào):92632,Dr.Ehrenstorfer GmbH,含量99.0%);羥基甲硝唑(MNZOH)對照品(批號(hào):281527,WITEGA公司,含量100%);羥甲基甲硝咪唑(HMMNI)對照品(批號(hào):272032,WITEGA公司,含量99.5%);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);甲酸(95%,色譜級(jí),美國Sigma公司);氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純);十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18-N)和NH2-丙基乙二胺吸附劑(NH2-PSA)(島津技邇公司)。
1.2 色譜與質(zhì)譜條件
色譜柱:Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 mm×100 mm);流動(dòng)相:A為含0.1%甲酸水溶液,B為甲醇;梯度洗脫程序:0~4 min,5%~15%A;4~4.1 min,15%~5%A;4.1~7 min,5%A。柱溫:30 ℃;流速:0.5 mL/min,進(jìn)樣量2 μL;運(yùn)行時(shí)間:7 min。
離子源:電噴霧離子源(ESI),正離子檢測方式(ESI+);多反應(yīng)檢測(MRM模式),MRM進(jìn)行分段掃描:0~2.7 min,MNZOH;2.7~4.2 min,HMMNI、MNZ和RNZ;4.2~7 min,DMZ;干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:10 L/min;噴霧器壓力:200 kPa;毛細(xì)管電壓:4 kV;校準(zhǔn)方法:質(zhì)量軸自動(dòng)調(diào)諧校正;其他質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表1。
表1 5種硝基咪唑類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for 5 nitromidazoles
*quantitative ion pair
1.3 樣品制備
提?。簻?zhǔn)確稱取5.0 g魚肉試樣于50 mL聚丙烯離心管中,精密加入10 mL含0.1%(體積分?jǐn)?shù))氨水的乙腈溶液,充分均質(zhì)提取5 min,加入2 g氯化鈉和5 g無水硫酸鈉,旋渦1 min,以5 000 r/min離心5 min,將有機(jī)相全部轉(zhuǎn)入10 mL聚丙烯離心管中,待凈化。
凈化:在待凈化樣液中加入凈化劑(內(nèi)含1 000 mg無水硫酸鈉,200 mg C18-N以及200 mg NH2-PSA),旋渦1 min混勻,以5 000 r/min離心5 min,精密取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至試管中,40 ℃水浴下氮吹至干,精密加入1 mL 0.1%甲酸水-乙腈(90∶10,體積比),旋渦混勻1 min溶解殘?jiān)?,?.22 μm微孔濾膜過濾。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
分別精密稱取MNZ、DMZ、RNZ 以及兩種代謝產(chǎn)物MNZOH及HMMNI標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg,分別用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,作為對照品儲(chǔ)備溶液(質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L)。分別精密吸取上述5種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適當(dāng)體積于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。精密吸取適當(dāng)體積的該中間溶液,配成20、50、80、100、200、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。
2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化
分別取MNZ、DMZ、RNZ、MNZOH及HMMNI質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化。在ESI離子源下,分別用正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種化合物均在ESI+模式下響應(yīng)最好,故本方法采用正離子模式進(jìn)行檢測。
在正離子模式下對5種硝基咪唑類化合物進(jìn)行母離子掃描,掃描范圍為m/z150~250,得到 [M+H]+峰。確定母離子之后,調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)牧呀怆妷?,使得各母離子一級(jí)掃描時(shí)響應(yīng)最高。確定母離子及其裂解電壓,繼續(xù)進(jìn)行子離子掃描,以得到最佳的二級(jí)質(zhì)譜條件,經(jīng)儀器自帶的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)自動(dòng)優(yōu)化程序,得到5種化合物的二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)(表1)。
圖2 5種硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品的總離子圖和MRM定量離子圖Fig.2 TIC and MRM of five NMZs reference standards
2.2 色譜條件優(yōu)化
本方法對Waters CORTECS-C18(2.7 μm,3.0 mm×50 mm)、Waters XBridge-C18(3.5 μm,3.0 mm×50 mm)、Merck Chromolith RP-18e(4.6 mm×100 mm)3種色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,普通的C18柱(CORTECS-C18和XBridge-C18)在分離MNZ和RNZ時(shí)比較困難,所以采用整體化色譜柱Merck Chromolith RP-18e進(jìn)行分析。整體化色譜柱是利用極高純度且不含金屬的烷氧基硅膠為材料,采用新的液溶膠技術(shù)制備得到的整體化的多孔硅膠棒。這種硅膠棒具有典型的孔結(jié)構(gòu),即: 大孔結(jié)構(gòu)和中孔結(jié)構(gòu),其中大孔的孔徑為2 μm,相互交聯(lián)成密集的大孔網(wǎng)絡(luò),保證流動(dòng)相可以快速通過,卻不會(huì)造成大的反壓。填料骨架上13 nm的中孔保證了填料具有比顆粒型色譜柱更高的比表面積,從而可使該色譜柱在保證高柱效和低反壓的條件下使用高流速,具有較好的色譜柱柱效。結(jié)果如圖2所示,Merck Chromolith RP-18e對5種硝基咪唑類化合物的分離效果良好。
選擇合適的流動(dòng)相能直接影響目標(biāo)化合物的分離、靈敏度等[16]。由于乙腈的極性高于甲醇,采用水相-乙腈體系作為流動(dòng)相時(shí),5種硝基咪唑類化合物的分離效果較差,分離度均未達(dá)到1.5,所以本研究采用極性相對較弱的甲醇作為有機(jī)相。在水相中加入一定比例的甲酸能促進(jìn)離子化,因此本研究考察了不同含量的甲酸水溶液(0.1%、0.15%、0.2%)對5種目標(biāo)化合物的分離效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸含量為0.1%時(shí),5種目標(biāo)化合物的分離效果最佳,且離子化程度較好,而當(dāng)采用另外兩個(gè)較高含量的甲酸水溶液時(shí),MNZ和RNZ的分離度變差(<1.5)。因此本研究選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇為最佳的流動(dòng)相。
2.3 提取及凈化方式的優(yōu)化
水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物的提取溶劑一般采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈以及一些混合溶劑,而分散固相萃取法提取獸藥殘留常采用的提取溶劑為含0.1%甲酸的乙腈溶液,所以本方法采用乙腈作為提取劑[17-18]。硝基咪唑類藥物具有酸堿兩性化學(xué)性質(zhì),在弱酸性條件下呈質(zhì)子化狀態(tài),在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài),酸堿條件對MNZOH和HMMNI兩種代謝產(chǎn)物的提取率影響較大,采用含0.1%甲酸的乙腈溶液作為硝基咪唑類藥物的提取劑時(shí),MNZOH和HMMNI的回收率均低于30%,其余3種硝基咪唑類藥物的回收率為50%~60%,所以本文考慮在乙腈提取液中加入少量堿性物質(zhì)來提高提取率。分別采用含0.05%、0.1%、0.15%氨水的乙腈溶液作為提取溶劑,結(jié)果顯示,采用含0.1%氨水的乙腈時(shí)提取效率最高,5種硝基咪唑類藥物的回收率均達(dá)到75%以上,并且氨水類揮發(fā)性堿性成分不會(huì)污染質(zhì)譜離子源,符合實(shí)驗(yàn)要求。
表2 無水硫酸鈉、C18-N及NH2-PSA用量配比的正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Orthogonal test factors and levels of the dosages of Na2SO4,C18-N and NH2-PSA
分散固相萃取常用的凈化吸附劑為無水硫酸鈉、C18-N、NH2-PSA,其中無水硫酸鈉(一般用量為500~1 500 mg)主要用于除去樣液中的水分,以保證其他吸附劑的吸附能力,C18-N(一般用量為100~300 mg)用于除去脂肪類雜質(zhì),NH2-PSA(一般用量為100~300 mg)主要吸附色素、金屬離子、有機(jī)酸等。本研究通過對3種吸附劑的用量配比進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化(無水硫酸鈉、C18-N以及NH2-PSA用量分別作為因素A、B、C),每個(gè)因素取3個(gè)水平,按照L9(33)正交表試驗(yàn),比較50 μg/L加標(biāo)水平下各因素組合的回收率和凈化效果,來選擇最佳配比組合。正交試驗(yàn)因素見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果表明,使用1 000 mg無水硫酸鈉、200 mg C18-N以及200 mg NH2-PSA組成的凈化劑可以獲得良好的凈化效果。
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對方法靈敏度、精密度以及準(zhǔn)確度造成影響[18]。MNZ、DMZ和RNZ在水產(chǎn)品中的基質(zhì)效應(yīng)不明顯,但MNZOH和HMMNI存在一定的基質(zhì)效應(yīng),本研究通過優(yōu)化色譜分離條件較好地消除了基質(zhì)效應(yīng),并采用相應(yīng)基質(zhì)配制標(biāo)樣進(jìn)行校準(zhǔn),有效保證了定性、定量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。
2.5 線性關(guān)系與定量下限
取“1.4”配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,分別進(jìn)樣1 μL,以定量監(jiān)測離子對離子流中譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系考察,結(jié)果見表3。5種硝基咪唑類藥物線性關(guān)系較好,r2≥0.998 9。
取空白樣品5 g,加入適當(dāng)稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按本方法制備供試品溶液分別進(jìn)樣測定,得5種硝基咪唑類藥物的檢出限(LOD,S/N=3)與定量下限(LOQ,S/N=10)分別為0.2~0.7 μg/kg和0.7~2.0 μg/kg,結(jié)果見表3。
表3 5種硝基咪唑類藥物的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 3 Linear regression results,LODs and LOQs of five NMZs
2.6 方法回收率與精密度
取空白樣品,每份5 g,分別加入適量的混合對照品溶液,使供試品溶液最終加標(biāo)水平分別為10、20、50 μg/kg,平行6份,按樣品制備方法制備供試品溶液,檢測含量并計(jì)算回收率,結(jié)果見表4。5種硝基咪唑類藥物的平均回收率為77.2%~94.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%~7.8%。
表4 平均回收率與精密度(n=6)Table 4 Average recoveries and precision(n=6)
2.7 實(shí)際樣品檢測
利用本研究建立的方法對杭州市市售的50批次水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類藥物進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),50批次水產(chǎn)品中均未檢出5種硝基咪唑類藥物殘留。
本研究建立了分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的分析方法,同時(shí)優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件以及提取和凈化條件。該方法無需復(fù)雜的樣品前處理,經(jīng)含0.1%氨水的乙腈溶液提取,使用1 000 mg無水硫酸鈉、200 mg C18-N以及200 mg NH2-PSA組成的凈化劑進(jìn)行凈化吸附,即可有效降低基質(zhì)效應(yīng),提高分析方法的選擇性和靈敏度。
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Determination of Five Nitromidazoles in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Combined with Dispersive Solid Phase Extraction
LI Jiong1*,SUN Lan1,WANG Hong-qing1,QIU Hong-yu1,KANG Jian2
(1.Hangzhou Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310017,China;2.Shimadzu-GL Sciences(Shanghai)Laboratory Supplies Co.,Ltd.,Shanghai 200052,China)
A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was developed for the determination of five nitromidazoles in aquatic products.Samples were extracted with acetonitrile containing 0.1%(by volume) ammonium hydroxide,and then purified with a mixture of anhydrous sodium sulfate,C18-N and NH2-PSA.The analysis was performed by an HPLC-MS/MS system with Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 mm×100 mm) column.The mobile phase consisted of methanol and 0.1%(by volume) formic acid solution by gradient elution,and multiple reaction monitoring(MRM) mode with positive electrospray ionization was used.The effects of the dosages of ammonium hydroxide in extractant and anhydrous sodium sulfate,C18-N and NH2-PSA in cleaning-up agent were studied.Under the optimized analytical conditions,the calibration curves for five nitromidazoles were linear in the concentration range of 20-500 μg/L with their correlation coefficients(r2) not less than 0.998 9.The recoveries at three concentrations ranged from 77.2%to 94.8%with the LOQs of 0.7-2.0 μg/kg.The method is suitable for the determination of 5 nitromidazoles in aquatic products.
high performance liquid chromatography;tandem mass spectrometry;dispersive solid phase extraction;nitromidazole;aquatic product
2017-06-29;
2017-08-16
*
勵(lì) 炯,碩士,副主任技師,研究方向:藥品、食品、保健品檢驗(yàn),Tel:0571-85463893,E-mail:jokelee2@126.com
10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.011
O657.63;O657.7
A
1004-4957(2017)11-1357-06