高小寬，梁魁景，馬燁煒，李 露

三七提取物對貯藏期梨黑斑病的防治研究

高小寬，梁魁景，馬燁煒，李 露

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北衡水 053000）

以貯藏梨為試驗材料，研究三七提取物對梨果實體內(nèi)損傷接種的影響，從而篩選出三七提取物最佳抑制濃度。結(jié)果表明：體內(nèi)損傷接種試驗結(jié)果看出，各濃度的三七提取物明顯抑制了損傷接種梨黑斑病菌果實病斑面積的擴展，降低損傷接種果實的發(fā)病率，其中濃度為4000mg/L的抑菌效果最好，抑制率達(dá)到53.63%，毒力最強，EC50為 1918.079mg/L。

三七提取物；貯藏期梨；黑斑病

本試驗選用不同濃度的中藥三七提取物的有效成分，體內(nèi)試驗篩選出提取物對梨黑斑病抑制的最佳濃度，以期為中藥三七提取物防治梨黑斑病提供依據(jù)，為新型生物防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 三七提取物由西安匯森生物科技有限公司提供（表1）。其提取物生產(chǎn)工藝為原料植物經(jīng)粉碎后用70%乙醇提取3遍，液體合并過濾，經(jīng)濃縮、噴粉、干燥、粉碎過篩，成品包裝。

表1 三七提取物成分和性狀

供試植物病原菌為梨貯藏期黑斑病，采自衡水舊城村梨園帶病梨果，經(jīng)貯藏15d后取病組織分離得到梨黑斑病菌。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化和鑒定 參照方中達(dá)方法[5]。用70%酒精擦拭病果表面，無菌水沖洗干凈后，切取一小塊染病組織，在超凈工作臺中移到PDA培養(yǎng)基上，于25℃保溫培養(yǎng)，待長出分生孢子后進行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上保存待用。各菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至菌落直徑接近 2/3培養(yǎng)皿直徑時，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基制備 參照方中達(dá)方法[5]進行。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無菌水1000mL，煮沸30min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20g，加熱熔化加入葡萄糖20g。待葡萄糖溶解后，加入適量的水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1000mL。分裝后，在0.103Mpa，121℃下，高壓蒸氣滅菌20min。

1.2.3 孢子懸浮液制備 取出預(yù)先培養(yǎng)好的備用病原菌，在無菌條件下，往培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基上加入含有0.01%Tween80的無菌水10mL，用已消毒的毛筆將互隔交鏈孢孢子從培養(yǎng)皿上輕輕刮下，制成濃度為1x106CFU/mL的孢子懸浮液，懸浮液孢子計數(shù)采用在10×10倍顯微鏡下每視野30～35個分生孢子。

1.2.4 體內(nèi)損傷接種試驗 參照曹建康方法[6]并修改。選取大小均一、無病蟲危害的梨果實，自來水洗凈后，70%酒精擦拭梨表面，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌過的紙吸取殘留在果實表面水分，再用滅菌鐵釘（直徑3mm）在每個梨中部等距離刺3mm深的小孔3個，分別用0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L和 0.025g/L五個濃度梯度的三七提取液浸泡10min，拿出后晾1.5～3h。提前培養(yǎng)好梨黑斑病病菌，用滅過菌的直徑為6mm的打孔器在菌落邊緣鉆取一定量菌餅，將菌餅貼在梨的傷口上，用保鮮膜（PE薄膜）包裹后放在托盤中。在室溫下貯藏，每天在相同時間用十字交叉法測量梨果的病斑直徑。計算果實表面病斑面積并分析記錄數(shù)據(jù)。每處理10個果子，重復(fù)3次。 1.3 處理試驗數(shù)據(jù) 將三七提取物質(zhì)量濃度的對數(shù)設(shè)置為橫軸，將抑制率幾率值設(shè)置為縱軸并作圖，得出毒力回歸方程及有效抑制中濃度（EC50）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七提取物對貯藏期梨黑斑病的抑制

2.1.1 對病斑直徑擴展的抑制 各濃度的三七提取物處理與對照相比均能顯著抑制損傷接種蘋果梨果實病斑直徑的擴展，濃度越高抑制效果越明顯（圖1）。用4000mg/L、2000mg/L、1000mg/L、500mg/L和250mg/L五種濃度處理后果實的病斑直徑分別為對照的46.5%，49.6%，50.8%，61.3%，62.5%，且與對照間差異達(dá)顯著水平。

圖1 三七提取物對損傷接種蘋果梨病斑直徑的影響

2.1.2 體內(nèi)損傷接種的毒力測定 將試驗數(shù)據(jù)輸入Excel表格計算出提取物的毒力回歸曲線及 EC50值（表2）。三七提取物的EC50為1918.079mg/L。

表2 三七提取物對梨黑斑病菌菌絲生長的毒力值

2.1.3 體內(nèi)損傷接種試驗的抑菌率 通過每天測量梨的病斑直徑，得出五種濃度的三七提取物對體內(nèi)損傷接種果實的發(fā)病率均有一定的抑制活性，且提取物濃度越高，發(fā)病率越低（表3）。試驗結(jié)果表明三七提取物的濃度為4000mg/L的抑制效果最好。

表3 三七提取物對梨黑斑病病斑生長的影響

3 結(jié)論與討論

三七提取物對梨黑斑病的菌落生長、菌絲伸長和在體內(nèi)損傷接種試驗中均具有不同程度的抑制效果。在體內(nèi)損傷接種試驗中，4000mg/L的抑菌效果最好，抑制率達(dá)53.63%，毒力最強，EC50為1918.079mg/L。

體內(nèi)損傷接種實驗的結(jié)果不如體外抑菌實驗的結(jié)果明顯，主要原因可能是由于浸泡時間過短導(dǎo)致三七提取物滲入果實組織的濃度不夠，也可能是由于用三七提取物浸泡后在進行損傷接種的時間間隔過短，沒能有效激發(fā)果實的抗性。具體原因有待進一步研究。

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S661.2

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10.19440/j.cnki.1006-9402.2017.06.004

2017-10-11

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（項目編號：QN2016329）

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