陳自雅 江 岸 李 平 謝肄聰

1.天津市第五中心醫(yī)院,天津 300450；2.天津醫(yī)科大學研究生院,天津 300070；3.天津市南開醫(yī)院,天津 300193；4.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院,天津 300052

實驗研究

針灸對氣虛血瘀型糖尿病大鼠模型下肢血管病變的影響

陳自雅1江 岸2李 平3謝肄聰4

1.天津市第五中心醫(yī)院,天津 300450；2.天津醫(yī)科大學研究生院,天津 300070；3.天津市南開醫(yī)院,天津 300193；4.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院,天津 300052

目的：探討針灸療法對氣虛血瘀證2型糖尿病大鼠下肢血管病變的影響。方法：將35只雄性SD大鼠分為對照組7只、模型組14只和針灸組14只。通過高脂喂養(yǎng)、大黃灌胃聯(lián)合多次尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立氣虛血瘀型2型糖尿病大鼠模型，針灸胰俞穴、足三里進行干預，動態(tài)觀察針灸對2型糖尿病大鼠血清氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)和股動脈血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體LOX-1表達的影響。結果：與對照組比較，模型組大鼠血清Ox-LDL水平和LOX-1蛋白表達明顯升高 (Plt;0.05)，與模型組比較，針灸組大鼠血清Ox-LDL水平和LOX-1蛋白表達顯著降低 (Plt;0.05)。結論：2型糖尿病大鼠血清Ox-LDL顯著升高，提示血管病變的發(fā)生，針灸干預可通過降低LOX-1蛋白表達抑制2型糖尿病大鼠血管病變。

血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體；針灸；糖尿病血管病變

糖尿病下肢血管病變作為2型糖尿病患者截肢、致殘的主要原因，其病理基礎是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，AS與脂代謝紊亂、氧化應激等關系密切，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是引發(fā)血管炎癥反應，導致AS形成和發(fā)展的關鍵因素。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體 (LOX-1)是Ox-LDL特異性受體，在動脈粥樣硬化產(chǎn)生和血管的驗證反應性中發(fā)揮重要作用[3]。Liu等[4]研究顯示正常人血管內(nèi)膜LOX-1低水平表達，而在發(fā)生AS血管處的內(nèi)皮細胞和巨噬細胞中LOX-1表達水平明顯增加。研究通過動態(tài)觀察針灸對2型糖尿病大鼠血清Ox-LDL和股動脈LOX-1表達的影響，探索針灸胰俞穴、足三里對2型糖尿病大鼠下肢血管病變影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性8周齡SD大鼠35只，體重180～220g，許可證號SCXK(京)2009-0017，飼養(yǎng)于生物醫(yī)學工程研究所動物實驗中心飼養(yǎng)室。

1.2 試劑與設備 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；檸檬酸(天津市巴斯夫化工有限公司)；Ox-LDL試劑盒(北京鼎國昌盛生物有限公司)；LOX-1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；LOX-1β-actin(中杉金橋)。毫針(0.25mm×40mm，天津鵬世醫(yī)療器械銷售有限公司，英迪 KWD-808Ⅰ型脈沖針灸治療儀(常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 動物分組與造模 SD大鼠7只/籠，適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為對照組(7只)和實驗組(28只)。對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。實驗組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)6周，后2周聯(lián)合大黃灌胃，于次日清晨稱取實驗組大鼠體重，按25mg/kg尾靜脈注射STZ，1周后割尾法取血測血糖，隨機血糖大于16.7mmol/L為T2DM造模成功，血糖不達標者按25mg/kg再次尾靜脈注射STZ。高脂飼料配方：1%的膽固醇，10%的豬油，10%的蔗糖，0.3%的膽酸鈉，其中78.7%為普通飼料。大黃煎劑的制備：按人與鼠1∶10 比例給藥，10g 大黃顆粒劑溶解在50mL 80℃蒸餾水中浸泡5min，取出待其自然冷卻，用紗布過濾，4℃冰箱保存，灌胃時用25℃溫水浸泡至室溫，按0.17g/100g 給藥，隔日1次，共14d。按血糖水平、體重大小對實驗組大鼠進行隨機區(qū)組分組，分為模型組(n=14)和針灸組(n=14)。

1.4 干預方法 針灸組取“胰俞穴”和“足三里”，用英迪KWD-808 I型脈沖針灸治療儀進行電針刺激，電流1mA，頻率2Hz，同時艾灸胰俞穴和足三里，每次刺激10min，每日1次，共干預4周。期間模型組和針灸組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周，每周測定體重、血糖。

1.5 動物取材與結果檢測 所有大鼠處死前一天禁食，麻醉后腹主動脈抽血置于5mL促凝管中，2h內(nèi)以2500rpm的速度離心約10～15min取血清，將血清置于-20℃冰箱，使用酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)法測定血清Ox-LDL濃度。分離剪取雙側(cè)股動脈約1～2mm，立即放入凍存管丟入液氮中凍存，用于Western Blot測定LOX-1的蛋白表達量。

2 結果

2.1 氣虛血瘀型T2DM模型的建立 采用高脂飼料喂養(yǎng)6周，后2周同時給予大黃灌胃，聯(lián)合多次(間隔時間為7d，大部分經(jīng)2次注射)尾靜脈注射小劑量STZ(25mg/kg)的方法建立氣虛血瘀型T2DM大鼠模型。造模后1周割尾法取血檢測兩組大鼠血糖，隨機血糖大于16.7mmol/L者造模成功。造模1周后大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食等典型的T2DM臨床表現(xiàn)。同時出現(xiàn)毛發(fā)枯黃沒有光澤，倦怠嗜睡，活動量明顯減少，眼球暗紅，爪甲青紫等氣虛血瘀的臨床表現(xiàn)。尾靜脈注射后1周各組大鼠的尾靜脈血糖水平見表1。由表1可知，與注射前比較對照組血糖無明顯著變化(Pgt;0.05)，實驗組大鼠血糖水平明顯升高(Plt;0.05)。尾靜脈注射前，實驗組大鼠血糖水平正常，注射一周后血糖水平明顯升高，且出現(xiàn)多飲、多尿、多食T2DM的臨床表現(xiàn)和毛發(fā)枯黃沒有光澤，倦怠嗜睡，活動量明顯減少，眼球暗紅，爪甲青紫等氣虛血瘀的臨床表現(xiàn)，符合氣虛血瘀型T2DM的臨床特征。

組別例數(shù)基礎血糖尾靜脈注射1周血糖對照組75.64±0.275.86±0.55實驗組285.75±0.5524.44±3.40★

注：與本組注射前比較，★Plt;0.05。

2.2 血清Ox-LDL濃度 各組大鼠血清Ox-LDL濃度水平見表2和圖1。與對照組比較，模型組大鼠血清Ox-LDL明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.471，P=0.003lt;0.05)。與模型組比較，針灸組大鼠血清Ox-LDL明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.239，P=0.036lt;0.05)，提示針灸能降低T2DM大鼠血清Ox-LDL水平。

組別例數(shù)Ox-LDL對照組75.36±0.41模型組146.16±0.49▲針灸組145.66±0.60◆

注：與對照組比較，▲Plt;0.05；與模型組比較，◆Plt;0.05。

2.3 LOX-1蛋白定量檢測 各組大鼠股動脈組織LOX-1 Western Blot蛋白定量結果見表3和圖2。與對照組比較，模型組的LOX-1蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.235，P=0.038lt;0.05)。與模型組比較，針灸組的LOX-1蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.841，P=0.009lt;0.05)。提示T2DM大鼠股動脈LOX-1蛋白表達水平上調(diào)，針灸干預4周可以有效的抑制LOX-1蛋白表達水平上調(diào)。

組別例數(shù)LOX-1相對灰度值對照組70.68±0.07模型組140.91±0.26▲針灸組140.70±0.07◆

注：與對照組比較，▲Plt;0.05；與模型組比較，◆Plt;0.05。

3 討論

2型糖尿病常伴糖脂代謝紊亂、高血糖和脂代謝紊亂通過多種途徑產(chǎn)生過量活性氧(ROS)導致氧化應激，氧化應激引起LDL發(fā)生氧化修飾，生成Ox-LDL，LDL經(jīng)氧化修飾形成Ox-LDL后不再與LDL受體結合， LOX-1表達于血管內(nèi)皮細胞外膜上，作為Ox-LDL的主要受體，可特異性結合、攝取、降解Ox-LDL，同時誘導內(nèi)皮細胞表達選擇素、單核細胞趨化因子1、ICAM-1、VCAM-1等細胞因子，促進單核細胞在血管內(nèi)皮的遷移、粘附，遷入內(nèi)膜的單核細胞分化為巨噬細胞，進一步結合吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細胞。因此，LOX-1在糖尿病下肢血管病變形成發(fā)展過程中具有重要作用[5]。

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)、大黃灌胃聯(lián)合多次尾靜脈注射小劑量STZ(25mg/Kg)建立氣虛血瘀型T2DM大鼠模型，針灸胰俞穴、足三里進行干預，血清Ox-LDL酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測結果顯示，與對照組比較，模型組T2DM大鼠血清Ox-LDL表達明顯增加，證實了Ox-LDL可促進T2DM血管病變的發(fā)生；而與模型組比較，針灸組大鼠血清Ox-LDL表達明顯降低，說明針灸干預可通過降低Ox-LDL表達抑制T2DM血管病變。股動脈LOX-1免疫組化和Western Blot結果顯示，與對照組比較，模型組T2DM大鼠LOX-1蛋白的表達顯著增加，證實LOX-1可促進T2DM血管病變的發(fā)生；而與模型組比較，針灸組大鼠LOX-1蛋白表達明顯降低，說明針灸干預可通過降低LOX-1蛋白表達抑制T2DM血管病變。

胰俞穴為胰臟的經(jīng)氣上輸背部處，為治療糖尿病的特效穴?，F(xiàn)代研究顯示，胰腺主要受T8神經(jīng)支配，胰俞穴處有T8神經(jīng)分布。因此針灸胰俞穴能夠調(diào)節(jié)胰腺的功能，降低血糖。高珊等[6]研究表明，電針胰俞穴能夠增強胰島素敏感指數(shù)。足三里分布在胃經(jīng)上，脾胃為氣血生化之源，因此針灸足三里能夠補益氣血、行氣活血。王景等[7]研究表明足三里穴位注射可降低糖尿病患者證候積分。《素問·舉痛論》記載：“寒氣入經(jīng)……泣而不行……得灸而痛立止”。大量研究也表明艾灸能夠溫經(jīng)散寒、活血行氣。針灸對糖尿病的作用已得到廣泛認可，但其具體作用機制尚不明確。李夢等[8]研究表明，電針“內(nèi)關”、“心俞穴”能夠減少冠心病大鼠Ox-LDL和LOX-1的表達。

研究針對LEAD選取“胰俞穴”、“足三里”，針灸兩穴進行干預治療，與模型組比較，針灸組大鼠Ox-LDL的表達顯著降低 (Plt;0.05)，LOX-1蛋白表達顯著降低(Plt;0.05)。針灸可能通過降低2型糖尿病大鼠下肢血管LOX-1、Ox-LDL的表達水平，發(fā)揮改善2型糖尿病大鼠下肢血管病變的作用。

[1]管珩,劉志民,李光偉,等.50 歲以上糖尿病人群周圍動脈閉塞性疾病相關因素分析[J].中華醫(yī)學雜志, 2007,87(1): 23-27.

[2]陳家偉.糖尿病動脈粥樣硬化中的炎癥機制[J].國外醫(yī)學·內(nèi)分泌學分冊, 2004, 24(4):2-3.

[3]杜月光,錢俊文,宋光明,等.LOX-1在2型糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)中的表達及其意義[J].中國病理生理雜志,2013,29(1):50-55.

[4]Liu J, Grundy SM, Wang W, et al.l Ten-year risk of cardiovascular incidence related to diabetes, prediabetes, and themetabolic syndrome [J]. Am Heart J,2007,153(4): 552-558.

[5]Geneviève, Renie.Diabetic vasculopathy and the lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1). Current diabetes reviews[J].2007,3(2):103-110.

[6]高珊,李瑞,田環(huán)環(huán),等.針灸“胰俞”穴對2型糖尿病大鼠HPA軸相關激素的影響[J].中國針灸,2014,34(1):1099-1110.

[7]王景,滕琳,郭偉光.足三里穴位注射對糖尿病下肢血管神經(jīng)病變患者神經(jīng)傳導速度的影響[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(1):42-44.

[8]李夢,蔡榮林,胡玲,等.針灸對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病模型大鼠血清氧化低密度脂蛋白及其受體表達的影響[J].中國針灸,2013,33(9):817-820.

Effect of Acupuncture and Moxibustion on Vascular Lesions of Lower Limbs in Diabetic Rats with Qi Deficiency and Blood Stasis Syndrome

CHEN Ziya1JIANG An2LI Ping3XIE Yicong4

1.The Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450, China;2.Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;3.Tianjin Hospital of Itcwm Nankai Hospital, Tianjin 300193, China;4.General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Objective To investigate the effect of acupuncture on lower extremity vascular disease in type 2 diabetic rats with Qi deficiency and blood stasis syndrome. Methods 35 male SD rats were divided into two groups: control group of 7, model group of 14 and acupuncture group of 14. The high fat diet, rhubarb combined with multiple intravenous injection of a small dose of streptozotocin (STZ) of qi deficiency and blood stasis rat model of type 2 diabetes, Yu Xue, Zusanli acupuncture pancreas intervention, dynamic observation of acupuncture effect on the expression of LOX-1 in serum of Ox-LDL vein and femoral in type 2 diabetic rats. Results Compared with the control group, the expression of model group rats serum levels of Ox-LDL and LOX-1 protein increased significantly (Plt;0.05), compared with the model group, the expression of acupuncture group rats serum levels of Ox-LDL and LOX-1 protein decreased significantly (Plt;0.05).Conclusion The serum Ox-LDL levels in type 2 diabetic rats increased significantly, suggesting the occurrence of vasculopathy, and acupuncture intervention could inhibit the vascular lesion in type 2 diabetic rats by decreasing the expression of LOX-1 protein.

Lectin Like Oxidized Low-density Lipoprotein Receptor; Acupuncture; Diabetic Angiopathy

R-33

A

1007-8517(2017)20-0042-04

塘沽科委科技基金項目(2013KJXQ02)。

陳自雅(1969-)，女，漢族，本科，主任醫(yī)師，研究方向為中醫(yī)針灸治療常見病。E-mail：a11bb@126.com

2017-08-26 編輯：穆麗華)