王文靜

河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院第一藥劑科，河南 鄭州 450000

HPLC法測定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量

王文靜

河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院第一藥劑科，河南 鄭州 450000

目的：采用HPLC法測定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量。方法：采用Wondasil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以乙腈-0.033moL·L-1KH2PO4(磷酸調(diào)pH3.0，25∶75) 為流動相；流速為1.0 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫30℃。結(jié)果：黃芩苷、鹽酸小檗堿分別在4.50～226.31μg/mL、1.14～57.12μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果良好；黃芩苷和鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.04%、99.80%，RSD分別為1.74%、2.01%。結(jié)論：HPLC測定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，其靈敏、準(zhǔn)確，分離效果較好，可作為濕迪膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)提供依據(jù)。

濕迪膠囊；黃芩苷；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

濕迪處方是臨床常用的中藥經(jīng)驗(yàn)方，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及各種神經(jīng)痛有顯著療效[1-2]。濕迪膠囊是對該驗(yàn)方進(jìn)行二次開發(fā)后研制的新劑型，由黃柏、黃芩、蜈蚣3味中藥組成，為硬膠囊，內(nèi)容物為棕褐色顆粒，味微苦[3-4]。為確保用藥的安全有效，必須對其質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制，使嚴(yán)格按照處方及工藝要求生產(chǎn)。本研究采用高效液相色譜法對制劑的指標(biāo)性成分鹽酸小檗堿和黃芩苷進(jìn)行含量測定，為濕迪膠囊質(zhì)量控制方法的建立提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Shimadzu LC2010- HT高效液相色譜儀(日本島津科技有限公司)；SartriusA210P天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；EPED-20TF實(shí)驗(yàn)室級純水機(jī)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201326，中國食品藥品檢定研究院)；黃芩苷對照品(批號：110715-201318，中國食品藥品檢定研究院)；濕迪膠囊(由黃柏、黃芩、蜈蚣3味中藥材組成，中國藥科大學(xué)中藥制劑教研室制)。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Wondasil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-0.033moL/LKH2PO4(磷酸調(diào)pH3.0，25∶75) 為流動相；流速為1.0mL/min；檢測波長270nm；柱溫30℃。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷對照品30.32mg和鹽酸小檗堿對照品(在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h)7.14mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇適量使超聲溶解30min，定容，搖勻，制成含黃芩苷606.4μg/mL和鹽酸小檗堿142.8μg/mL混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.1g 膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，置于100mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲30min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例，分別稱取除黃芩之外的2味藥材，按制備工藝制成缺黃芩陰性對照樣品，按“2.3”項(xiàng)下同法制備陰性對照溶液；按處方比例分別稱取除黃柏之外的2味藥材，按制備工藝制成缺黃柏陰性對照樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)下同法制備陰性對照溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性和系統(tǒng)適用性 分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，考察在該色譜條件下的鹽酸小檗堿和黃芩苷的分離度、理論塔板數(shù)、峰對稱性等指標(biāo)。分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以黃芩苷峰計(jì)，理論塔板數(shù)均不低于7000，色譜峰分離度良好。結(jié)果如圖1。

2.5.2 線性關(guān)系 分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.8、2、4、8、10mL，甲醇定容于25mL容量瓶中，搖勻，在上述色譜條件下進(jìn)樣，分別測定黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積，以峰面積(Y)、對照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸。以峰面積(Y)，與對照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果線性關(guān)系方程：黃芩苷為Y1=19190X1+12567，R2=0.9999，在4.50～226.31μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鹽酸小檗堿為Y2=28373X2+1834.3，R2=1，在1.14～57.12μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度 精密吸取混合對照品溶液(黃芩苷90.52μg/mL、鹽酸小檗堿22.85μg/mL)10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。黃芩苷、鹽酸小檗堿面積的RSD分別為0.19%、0.30%，精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性 取同一批次膠囊內(nèi)容物(批號20140423)6份，制成供試品溶液，精密吸取10μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品含量。黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的RSD分別是2.96%、2.00%，重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性 精密稱取0.1g膠囊內(nèi)容物(研細(xì))，分別于放置0、2、4、6、8h后進(jìn)行測定，進(jìn)樣10μL，記錄色譜峰面積。黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積RSD分別是2.53%和1.05%，穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率 取已知含量的膠囊內(nèi)容物0.05g，置于100mL容量瓶中，取己知含量的浸膏粉樣品0.03g，置于25mL容量瓶中，精密加入混合對照品(黃芩苷606.4μg/mL，鹽酸小檗堿142.8μg/mL)，按供試品溶液制備方法項(xiàng)下操作，平行6份，按供試品溶液制備方法項(xiàng)下操作，平行6份，測定黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積，計(jì)算回收率。黃芩苷和鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.04%、99.80%，RSD分別為1.74%、2.01%，表明本實(shí)驗(yàn)回收率良好，該方法能較好地滿足含量測定要求。見表1。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.6 含量測定 分別稱取三批次樣品(批號：20140421、20140421、2014042)，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，進(jìn)樣，測定峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算平均值，每個(gè)批號分別測定3次。3批號制劑樣品，如含量測定項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，由外標(biāo)法計(jì)算含量，見表3。結(jié)果表明3批濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量差異符合質(zhì)量要求。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

濕迪處方的有效成分及有效部位尚不明確，因此選用多個(gè)指標(biāo)成分的含量對膠囊質(zhì)量進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)分別以黃柏中的鹽酸小檗堿[5-6]、黃芩中的黃芩苷[7-8]作為指標(biāo)性成分，通過對流動相種類、比例的優(yōu)化，建立了高效液相色譜法同時(shí)測定黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。在對波長選擇中，黃芩苷最大吸收波長為275nm，鹽酸小檗堿最大吸收波長為265nm，兩者在270nm處有等吸收點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)選擇270nm作為檢測波長，兩者峰分離度較好、基線平直、靈敏度較高。在流動相系統(tǒng)的考察中，通過對比各流動相系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，乙腈-水系統(tǒng)效果較為理想。采用等度洗脫時(shí)，既能有效地分離黃芩苷和鹽酸小檗堿峰與其他峰，洗脫操作簡單，可保證樣品組分達(dá)到基線分離，能較好對黃芩苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行定性和定量，系統(tǒng)適用性較好。在流動相乙腈-水系統(tǒng)中，各峰形不是很好，對稱因子未全部達(dá)到要求，故考察了流動相pH的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用KH2PO4(磷酸調(diào)pH 3.0)溶液，分離效果較好，且各峰的對稱因子均在0.95～1.05之間，因此，確定乙腈-0.033moL/LKH2PO4(磷酸調(diào)pH 3.0，25∶75) 為流動相。該測定方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，陰性對照無干擾，可以作為新制劑質(zhì)量控制的方法。

本研究以黃芩苷和鹽酸小檗堿為指標(biāo)，建立了HPLC測定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的方法。結(jié)果表明，濕迪膠囊中黃芩苷含量不得少于5.0mg/粒，鹽酸小檗堿含量不得少于9.0mg/粒。本方法方法合理準(zhǔn)確、簡單、靈敏度高，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，符合藥典HPLC法的含量測定要求，有效保證了制劑質(zhì)量，可作為濕迪膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)提供依據(jù)。

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1007-8517(2017)20-0021-03

王文靜(1989-)，女，漢族，碩士研究生，中藥調(diào)劑員，研究方向?yàn)橹兴幖爸兴幹苿┭芯俊-mail: wangwenjing8949@163.com

2017-08-29 編輯：穆麗華)