賈 楠，李延年，董丹丹，張 會(huì)，李宜雷，朱元祺，*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003)

攜帶NDM-1基因ST571型肺炎克雷伯菌引起新生兒醫(yī)院感染暴發(fā)的研究

賈 楠1，李延年2，董丹丹1，張 會(huì)1，李宜雷1，朱元祺1，2*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003)

目的調(diào)查某醫(yī)院兒科分離的6株對(duì)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥基因型和相互間的同源性，為控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法采用梅里埃Vitek-2 Compact對(duì)6株肺炎克雷伯菌進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)。改良Hodge試驗(yàn)和金屬酶E條檢測(cè)菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增菌株是否攜帶碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和Ampc等耐藥基因，并測(cè)序確定其基因型。多位點(diǎn)序列(MLST)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)驗(yàn)證菌株之間的同源性。結(jié)果6株肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為多重耐藥性，對(duì)臨床常用的抗生素耐藥。所有菌株改良Hodge和金屬酶E條試驗(yàn)均陽性，且攜帶多個(gè)耐藥基因。其中5株菌，分別攜帶NDM-1、SHV-11、DHA-1、 oqxA和fosA3基因。另外1株ST11型肺炎克雷伯菌攜帶KPC-2 、CTX-M-65、TEM-1和OXA-1基因。5株攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯菌中,有4株的PFGE帶型相同， 且都為ST571型，另一株為ST76型，帶型與前4株不同。結(jié)論新生兒病房中存在攜帶NDM-1、SHV-11、DHA-1、 oqxA和fosA3基因的ST571型肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染暴發(fā)。

肺炎克雷伯菌；新生兒；醫(yī)院感染；新德里金屬β內(nèi)酰胺酶1型

(ChinJLabDiagn,2017,21:1873)

近年來，由于抗菌藥物的不合理使用，分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌日益增多。尤其是2009年報(bào)道自印度分離的一株新德里金屬β內(nèi)酰胺酶1型(NDM-1)的肺炎克雷伯菌以來，因其能夠水解除氨曲南以外所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，引起了廣泛的關(guān)注。兒童作為免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的特殊群體，處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，限制了抗生素的使用，這為臨床在治療兒童感染耐碳青霉烯類腸桿菌時(shí)帶來極大的困難。我們收集某醫(yī)院分離自兒童的6株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，對(duì)其進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有5株攜帶NDM-1，1株攜帶KPC-2，且脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示4菌株間存在同源性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 6株肺炎克雷伯菌(JX1-JX6)收集自某醫(yī)院兒科報(bào)告的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，其中分離自尿液(4/6)、血液(1/6)和分泌物(1/6)標(biāo)本。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2主要儀器與試劑 法國(guó)梅里埃Vitek-2 Compact系統(tǒng)全自動(dòng)微生物分析儀；瑞典AB Bio MérieuxTM公司E-test藥敏試紙條；英國(guó)Oxoid公司M-H培養(yǎng)基；大連寶生基因組提取試劑盒、瓊脂糖、PCR試劑盒和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；美國(guó)Bio-RAD公司MyCycle型PCR擴(kuò)增儀；美國(guó)Bio-RAD公司CHEF MAPPER XA型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀；美國(guó)Alpha Innotech公司HP3400型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1菌株的鑒定、藥敏和碳青霉烯篩選試驗(yàn) 使用Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果判定依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制定CLSI-2016標(biāo)準(zhǔn)。改良Hodge試驗(yàn)和金屬酶E-test試驗(yàn)按說明書進(jìn)行。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)、合成與耐藥基因的檢測(cè) 耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列依據(jù)文獻(xiàn)[1-4]，分別檢測(cè)碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaAIM、blaGIM、blaDIM和blaSIM)，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因( blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和blaOXA-1)， AmpC酶編碼基因(blaMOX、blaACC、blaDHA、blaCIT和blaEBC)，磷霉素fosA3基因和喹諾酮類耐藥基因(oqxA，oqxB)。引物合成和產(chǎn)物測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果與GeneBank(http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi)中序列進(jìn)行分析比對(duì)。

1.2.3多位點(diǎn)序列分型 依據(jù)http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網(wǎng)站提供的引物序列，擴(kuò)增7個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、tonB、rpoB)，擴(kuò)增反應(yīng)條件和片段大小見網(wǎng)站。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在MLST網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，以獲得細(xì)菌的ST分型。

1.2.4脈沖場(chǎng)凝膠電泳 利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)檢測(cè)菌株間同源性，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[5]。電泳條件設(shè)定：片段大小5-400 kb，場(chǎng)強(qiáng)6V，轉(zhuǎn)角120°，轉(zhuǎn)換時(shí)間0.22-35.38 s，電泳時(shí)間18 h 30 min。最后，將膠放入0.5%TBE稀釋的0.5 μg/ml EB中染色30 min，再放入去離子水中脫色120 min，凝膠成像儀拍照成像。結(jié)果分析依據(jù)Tenover規(guī)則[5]。

2 結(jié)果

2.1菌株的藥敏和耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

肺炎克雷伯菌JX1號(hào)株除了磺胺甲惡唑/甲氧芐啶外，對(duì)目前常用的抗生素全部耐藥。同樣，其他5株(JX2-JX6)肺炎克雷伯菌除了呋喃妥因、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和阿米卡星外，也呈現(xiàn)多重耐藥表型。6株菌改良Hodge和金屬酶E條試驗(yàn)均是陽性。經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序證實(shí)，除了JX1號(hào)菌株擴(kuò)增出blaKPC-2基因，其余5株均有blaNDM-1基因。同時(shí)，每一株菌也擴(kuò)增出多種其他耐藥基因。藥敏和基因檢測(cè)結(jié)果見表1和表2。

表1 肺炎克雷伯臨床株對(duì)抗生素的藥敏結(jié)果(μg/mL)

表2 肺炎克雷伯菌攜帶的耐藥基因和多位點(diǎn)分型

2.2菌株的多位點(diǎn)序列分型和脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)對(duì)每株菌7個(gè)管家基因擴(kuò)增測(cè)序，在http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網(wǎng)站比對(duì)，JX1和JX2分別屬于ST11和ST76型，而JX3-JX6屬于ST571型，見表2。

根據(jù)Tenover規(guī)則，6株肺炎克雷伯菌經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳按條帶分布被分為A、B、C型三個(gè)型。其中，JX3-6號(hào)菌株為A型，條帶位置及數(shù)目相差小于3條，表明這4株菌之間存在克隆聚集性，即新生兒科病房中存在攜帶blaNDM-1基因肺炎克雷伯菌的暴發(fā)感染。JX1和JX2分別為C和B型，與JX3-6號(hào)菌株沒有同源性，見圖1。

注：M，lambda ladder PFG marker；1-6，肺炎克雷伯菌臨床株(JX1-6)

圖1肺炎克雷伯菌XbaI酶切后脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖

3 討論

自首例產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌報(bào)道[6]以來，全球多個(gè)地區(qū)出現(xiàn)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌的散發(fā)或流行。尤其產(chǎn)NDM-1腸桿菌科細(xì)菌感染可導(dǎo)致相對(duì)高的死亡率引起越來越廣泛的關(guān)注。兒童群體中，由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，增加了這一群體感染的機(jī)率，并且兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，限制了喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等抗生素的應(yīng)用。作為最后一道防線的碳青霉烯類抗生素耐藥的出現(xiàn)，使兒童細(xì)菌感染的治療將比成年人面臨更多的困難。目前，全球報(bào)道兒童感染攜帶blaNDM-1的腸桿菌中，肺炎克雷伯菌占多數(shù)，并呈明顯上升趨勢(shì)[7]，這就使得控制產(chǎn)NDM-1腸桿菌的感染迫在眉睫。

本研究中，4株攜帶blaNDM-1的ST571型肺炎克雷伯菌(JX3-6)是主要的致病流行株，在分離時(shí)間上相近，且均分離自新生兒，有3株分離自尿液，1株分離自分泌物，雖然耐藥表型不完全一致，但脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示這4株菌在條帶分布上相差小于3條，根據(jù)Tenover規(guī)則判斷為暴發(fā)菌株,即該新生兒病房存在攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌的暴發(fā)感染。與先前報(bào)道攜帶blakpc-2的主要流行株型—ST258 為起源的克隆復(fù)合體(包含ST258、ST11和ST512等)一樣， 本次僅分離1株攜帶blakpc-2的ST11型肺炎克雷伯菌。

近年來，國(guó)內(nèi)外也有不少碳青霉烯類耐藥腸桿菌在兒童群體中暴發(fā)感染的研究[7,8]。攜帶blaNDM-1的ST571型肺炎克雷伯菌在中國(guó)也曾有過散發(fā)的病例[9]，但沒有該ST型暴發(fā)感染的報(bào)道。目前的研究顯示，感染多與侵入性操作、定植、抗生素的不合理使用、住院時(shí)間延長(zhǎng)等因素有關(guān)[10]。由于我們是回顧性研究，沒能收集環(huán)境采集的標(biāo)本，進(jìn)一步明確感染來源，下一步將繼續(xù)進(jìn)行該流行株基因環(huán)境的研究。

我們的研究表明，新生兒病房中存在攜帶NDM-1、SHV-11、DHA-1、 oqxA和fosA3基因的ST571型肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染暴發(fā)。因此，要引起臨床重視，并加強(qiáng)對(duì)碳青霉烯類耐藥腸桿菌的監(jiān)測(cè)。

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OutbreakofNDM-1-producingKlebsiellapneumoniaeST571isolatesinaneonatalunit,China

JIANan,LIYan-nian,DONGDan-dan,etal.

(TheMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,and control outbreak of nosocomial infections.MethodsTotal 6 strains of K.pneumoiae were isolated from urines (4/6),blood (1/6) and secretion(1/6) from October 2013 to September 2015.VITEK-2 Compact system (BioMérieux) was used for identification and antibiotic susceptibility test of these isolates.The carbapenemase sceening were done by modified Hodge test and metallo-beta-lactamases E-test(MBL,IMP+EDTA).The drug resistance genes encoding the extended-spectrum-β-lactamases ( CTX-M,SHV,TEM and OXA-1),AmpC enzymes ( MOX,ACC,DHA,CIT and EBC),carbapenemases (KPC,NDM,BIC,OXA-48,IMP,SPM,VIM,AIM,GIM,DIM and SIM),PMQR genes(oqxA,oqxB) were detected by using PCR and product sequencing.The clonal relatedness of the strains was determined by pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) and multilocus sequence typing(MLST).ResultsThe Hodge tests and metallo-beta-lactamases tests were positive in all of six K.pneumoniae isolates .Meanwhile these isolates were highly resistant to most of cephalosporins and carbapenems.One of six isolates carried blaKPC-2,five harbored blaNDM-1.Also other antibiotics resistant genes,encoding SHV-11,TEM-1,OXA1,CTX-M-65,DHA-1,oqxA and fosA3 genes were detected.The PFGE revealed that four ST571 K.pneumoniae strains isolated from neonates belong to the same type.ConclusionOut results showed that there was an outbreak of ST571 K.pneumoniae isolates harboreing the NDM-1,SHV-11,DHA-1,oqxA and fosA3 genes in the neonatal unit.

Klebsiella pneumonia;neonates;nosocomial infections;NDM-1

青島開發(fā)區(qū)重點(diǎn)科技發(fā)展項(xiàng)目(2013-1-82)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1873-04

R378.99

A

2017-05-13)