張治平+戴海博+耿園

摘 要：為了探討葉面噴施5-氨基乙酰丙酸（ALA）在黃瓜苗期的施用濃度和效果，以黃瓜品種津春4號3葉1心期的幼苗為材料，研究了不同濃度ALA對黃瓜幼苗葉片光合色素含量和抗氧化酶系統(tǒng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，葉面噴施10、30、50 mg/L的ALA可明顯提高黃瓜葉片葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）含量，降低Chl a/b比值；顯著增加超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化物酶（POD）活性，脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低超氧陰離子（O2-·）生成速率、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量；當(dāng)ALA濃度達(dá)100 mg/L時，黃瓜幼苗受到一定的氧化脅迫傷害。這些結(jié)果說明，噴施濃度不超過100 mg/L ALA可促進(jìn)黃瓜幼苗葉片光合色素的合成、增加其抗氧化能力，降低膜脂過氧化的程度，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，以30 mg/L的ALA葉面噴施濃度在黃瓜幼苗上效果最佳。

關(guān)鍵詞：黃瓜；5-氨基乙酰丙酸（ALA）；葉綠素；抗氧化酶；氧化脅迫

中圖分類號：S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（2017）20-0088-05

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物體內(nèi)卟啉化合物（包括葉綠素、亞鐵血紅素、光敏素等）生成合成的第一個關(guān)鍵前體，與植物的光合作用、呼吸作用等有著密切關(guān)系，能夠調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，促進(jìn)作物的產(chǎn)量，提高植物的抗逆性[1～3]。然而ALA在黃瓜上的作用效果和施用濃度，目前存在著很大的差異。劉玉梅等[2]認(rèn)為0.5 mg/L ALA噴灑幼苗可以提高黃瓜品種津優(yōu)1號葉片凈光合速率（Pn）和光化學(xué)效率，提高黃瓜幼苗亞適宜溫光環(huán)境的光合適應(yīng)性。Zhen等[3]則認(rèn)為50 mg/L ALA緩解鹽脅迫對津春2號黃瓜造成的傷害最明顯。Tripathy等[4]研究表明，噴施20 mmol/L ALA能夠造成黃瓜的光合電子傳遞鏈的光動力損傷。為了確定葉面噴施ALA在黃瓜幼苗期的最佳施用濃度和應(yīng)用效果，本試驗(yàn)以黃瓜（Cucumis sativus L.）品種津春4號為材料，研究葉面噴施不同濃度ALA對黃瓜幼苗葉片葉綠素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白的含量、以及O2-·生成速率和MDA含量的影響，皆在探討ALA在黃瓜應(yīng)用上的濃度效應(yīng)，以期為ALA在黃瓜生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

本試驗(yàn)以黃瓜品種津春4號為材料。挑選飽滿的種子用50℃溫水浸種滅菌10 min，30℃恒溫箱中催芽 2 d，種子露白時，播種于裝有育苗專用基質(zhì)（鎮(zhèn)江興農(nóng)有機(jī)肥有限公司）的10 cm×10 cm（高度×口徑）黑色營養(yǎng)缽中，放入步入式植物生長箱（GBC-1600K型培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠）內(nèi)，培養(yǎng)條件設(shè)定溫度為（25±1）℃/（18±1）℃（晝/夜），光周期為12 h/12 h（晝/夜），最大光照強(qiáng)度為10萬lx，育苗期間每天上午8：00澆透水。

1.2 材料處理

黃瓜幼苗培養(yǎng)至3葉1心期，選取生長一致的植株，用10、30、50、100 mg/L的ALA（粉劑，購于Sigma公司）溶液噴施，并設(shè)清水（0 mg/L ALA）對照。噴施時溶液中添加0.01% Triton，均勻的噴灑葉片的正反面，以葉片滴水為噴施標(biāo)準(zhǔn)。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)20棵植株。ALA處理后第 4天，取第2片真葉測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 試驗(yàn)方法

①葉片光合色素的含量測定 采用參照Lichtenthaler[5]的方法，將黃瓜葉片剪碎放入小試管中，用 95%乙醇提取液黑暗中靜置提取24 h，測定470、649、665 nm的OD值，并計(jì)算葉綠素 a（Chl a）、葉綠素 b（Chl b）、總?cè)~綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）的含量以及Chl a/b的比值。

②抗氧化酶活性測定 SOD 活性測定按照 Beauchamp等[6]的氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法進(jìn)行，以引起50%光化還原抑制率的酶量為一個酶活性單位（U）。CAT活性測定參照Change 等[7]的方法，以每1 min OD240值減少0.01為1個酶活力單位（U）。APX 活性測定參照Nakano等[8]方法。POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，通過測定OD460的變化以測定POD的活力[7]。

③脯氨酸含量測定 脯氨酸含量測定參照張殿忠等[9]的磺基水楊酸提取法。

④可溶性蛋白含量測定 可溶性蛋白含量的測定按照 Bradford[10]的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，并以標(biāo)準(zhǔn)的BSA作對照。

⑤O2-·生成速率、H2O2和MDA含量測定 O2-·生成速率測定采用α-萘胺法[11]，H2O2含量的測定參照 Brennan 和Frenkel方法進(jìn)行[12]，MDA 含量的測定用硫代巴比妥酸（TBA）法，以μmol·g-1 （鮮樣質(zhì)量）表示[13]。

⑥統(tǒng)計(jì)分析 上述各項(xiàng)指標(biāo)的測定，均重復(fù)3次。采用Excel 2011和SAS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片光合色素的影響

噴施ALA可以明顯改變黃瓜葉片光合色素的含量，不同濃度的ALA的噴施效果差異較大。噴施10、30、50 mg/L ALA可以明顯提高黃瓜葉片葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）的含量，顯著降低了Chl a/b的比值；與噴施清水對照（0 mg/L ALA）相比，黃瓜葉片的Chl a、Chl b、總Chl和Car的含量分別提高了3.92%～10.8%、13.1%～23.7%、6.81%～16.1%和1.26%～7.18%，同時Chl a/b的比值降低了7.92%～12.9%，ALA的作用效果30 mg/L ALA>50 mg/L ALA>10 mg/L ALA，30、50 mg/L ALA的作用效果與對照相比均達(dá)到了差異顯著水平。然而隨著ALA濃度繼續(xù)升高（至100 mg/L），與對照相比，黃瓜葉片的Chl a和Car的含量顯著降低；Chl b和總Chl的含量以及Chl a/b的比值無顯著變化（表1）。endprint

2.2 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片抗氧化酶活性的影響

與對照相比，4種濃度ALA處理均增加了黃瓜葉片SOD、CAT、APX和POD 的活性。但ALA對黃瓜幼苗葉片4種抗氧化酶活性的作用效果不一樣，即隨著ALA濃度的增加，SOD的活性逐漸增加，而CAT、APX和POD的活性則呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢。黃瓜葉片SOD、CAT、APX和POD對ALA施用濃度反應(yīng)也不一樣。噴施10、30、50、100 mg/L ALA處理的黃瓜葉片SOD 的活性分別增17.4%。48.5%、56.2%、65.7%，且并到達(dá)了差異顯著水平（P<0.05），但3種ALA濃度之間沒有明顯差異。ALA濃度為30、50 mg/L時，對APX、CAT和POD 活性的增加效果顯著，為1.63～2.15倍；與對照相比，當(dāng)ALA濃度為50 mg/L時，對APX 和CAT 活性增加的效果最為明顯，分別為93.3%和115.2%，POD 活性增加的效果在ALA濃度為30 mg/L時表現(xiàn)的最明顯，其活性增加了105.3%。然而，當(dāng)ALA濃度到達(dá)100 mg/L，CAT、APX和POD 的活性有一定程度的降低，但仍顯著高于對照（P<0.05）（圖1）。

2.3 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

噴施10、30、50、100 mg/L ALA的黃瓜葉片脯氨酸的含量顯著增加（P<0.05），與對照相比分別提高了103%、192%、211%和115%。除100 mg/L的ALA處理對黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量影響不顯著外，其他處理的黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量顯著地高于對照（P<0.05），30 mg/L和50 mg/L ALA處理對黃瓜葉片的可溶性蛋白含量增加的效果較好，比對照提高了11.0%和14.3%（表2）。

2.4 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片O2-·生成速率、H2O2和MDA含量的影響

與對照相比，葉面噴施10、30、50 mg/L ALA顯著降低了黃瓜葉片O2-·生成速率，這3個ALA濃度處理的黃瓜葉片O2-·生成速率只有對照的61.4%～72.5%，以30 mg/L的ALA處理的O2-·生成速率降低的最為明顯；而100 mg/L的ALA處理的黃瓜葉片O2-·生成速率與對照相比差異不顯著。葉面噴施ALA對黃瓜葉片H2O2和MDA 含量變化的影響效果一致，表現(xiàn)為10 mg/L ALA對黃瓜葉片H2O2和MDA 含量沒有明顯影響；噴施30、50 mg/L ALA的黃瓜葉片H2O2和MDA含量與對照相比分別下降了74.8%～78.9%和69.5%～70.2%；當(dāng)ALA濃度到達(dá)100 mg/L，黃瓜葉片H2O2和MDA 含量比對照分別增加了123%、118%，增加效果顯著（P<0.05）（表2）。

3 討論

在植物體內(nèi)，ALA是葉綠素和血紅素的生物合成的第一個關(guān)鍵前體，CAT、POD和APX 同屬于亞鐵血紅素蛋白酶類，因而外源施用ALA，葉綠素含量和抗氧化酶活性的變化最能直觀地反映出外源ALA的作用效果[1，14～16]。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度ALA處理（10～50 mg/L）黃瓜幼苗，不僅能促進(jìn)黃瓜葉片光合色素Chl a、Chl b、總Chl的增加，還對葉綠素的成分比例產(chǎn)生影響，ALA對Chl b的促進(jìn)作用效果明顯大于Chl a，表現(xiàn)為與噴施清水對照相比Chl a/b的比值明顯降低。同時噴施10～50 mg/L ALA可以增加黃瓜葉片抗氧化酶SOD、CAT、APX和 POD 的活性，提高抗氧化物質(zhì)Car和Pro的含量，降低了O2-·的生成速率，H2O2和MDA 的含量。說明ALA在低濃度下可以促進(jìn)黃瓜葉片光合色素的合成，增加黃瓜的抗氧化能力，這與前人研究ALA在油菜、番茄、辣椒等植物上施用效果的結(jié)果是一致的[14～16]。

ALA對植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)作用的效果與ALA的施用濃度和作物種類密切相關(guān)，若ALA的濃度使用不當(dāng)，則調(diào)節(jié)作用效果減弱，并能對作物生長造成過氧化的傷害[14，17，18]。Zhang等[14]研究表明1 mg/L ALA可以促進(jìn)油菜的生長，而50 mg/L ALA誘導(dǎo)油菜體內(nèi)過氧化物質(zhì)積累，延緩植株的生長。100～400 mg/L ALA噴施紅掌幼苗葉片，可顯著增加葉綠素的含量，促進(jìn)幼苗的生長，并以ALA300 mg/L處理效果最佳[17]。即使在同一種作物上，ALA施用效果也存在著很大的差異[2～4]。本研究發(fā)現(xiàn)ALA對黃瓜品種津春4號幼苗的施用效果并不是和ALA的施用濃度成正比，而是存在一個最佳施用濃度，30 mg/L ALA施用效果最明顯。當(dāng)ALA的濃度達(dá)到100 mg/L時，黃瓜葉片內(nèi)的活性氧增加，脂膜過氧化程度增加，葉綠素含量降低，葉片顏色變淺，這可能是與ALA在高濃度下，一方面直接啟動細(xì)胞過氧化反應(yīng)，生成如 O2-·、H2O2和·OH等活性氧自由基，另一方面ALA代謝合成葉綠素和血紅素要經(jīng)過一些的酶促反應(yīng)，其中在黑暗條件，ALA可以轉(zhuǎn)化并積累光敏性很強(qiáng)的物質(zhì)——原卟啉原IX或者原卟啉IX，這些物質(zhì)如果黑暗中積累過量，再遇光，則誘發(fā)單線態(tài)氧，導(dǎo)致細(xì)胞的過氧化反應(yīng)，傷害甚至殺死細(xì)胞[14，18]。因此在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用ALA，其施用方法和濃度必須按照植物的品種特性、施用時期和ALA的純度等進(jìn)行嚴(yán)格的篩選，才能達(dá)到最佳的施用效果。

綜上所述，噴施ALA增強(qiáng)了黃瓜品種津春4號的光合色素的合成能力和抗氧化能力，降低O2-· 生成速率，抑制膜脂過氧化的產(chǎn)生；黃瓜葉面噴施ALA的濃度不宜過高，30 mg/L ALA即可達(dá)到最佳的施用效果。

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