陳繼兵+黃建都+林峰+林翮飛+林文

摘 要：利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對閩茄5號及其親本材料、新組合（06-29×06-16）及其親本材料的DNA特異型條帶進(jìn)行分析研究，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，從100對引物組合中篩選出1對引物（Em2/Me5）能擴(kuò)增出閩茄5號及其父本的多態(tài)性條帶；1對引物（Em3/Me3）能擴(kuò)增出新組合（06-29×06-16）及其父本的多態(tài)性條帶。說明該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于茄子近緣品種間的檢測。

關(guān)鍵詞：閩茄5號；茄子；SRAP；分子標(biāo)記

中圖分類號：S641.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（2017）20-0050-03

茄子（Solanum melongena L.）為茄科茄屬植物，是世界上熱帶和溫帶地區(qū)重要的蔬菜，含有多種維生素、脂肪、糖以及礦物質(zhì)等，特別是富含維生素P，具有許多藥用價(jià)值，是一種很好的保健蔬菜。閩茄5號是福州市蔬菜科學(xué)研究所選育的優(yōu)良茄子新品種，其母本為中晚熟類型06-29，父本為中熟類型06-13。閩茄5號屬中熟類型，較耐低溫弱光，始花節(jié)位10～11節(jié)，果形直，果色紫紅，果肉白，抗病性強(qiáng) [1]。2015年通過福建省非主要農(nóng)作物認(rèn)定，已在生產(chǎn)上大面積推廣。新組合（06-29×06-16）的母本與閩茄5號相同，父本為早熟類型06-16，在制種時(shí)容易發(fā)生混雜。種子純度是種子質(zhì)量的重要內(nèi)容，也是農(nóng)民增收的重要保證。因此，試驗(yàn)以閩茄5號及其親本和新組合（06-29×06-16）及其親本作為材料，通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，建立閩茄5號及新組合（06-29×06-16）DNA指紋圖譜，在提高種子質(zhì)量、純度檢測及生產(chǎn)推廣方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

閩茄5號及其父本1、新組合（06-29×06-16）及其父本2和共同的母本均由福州市蔬菜科學(xué)研究所茄子課題組提供。采用穴盤育苗，待幼苗長到2～3片真葉時(shí)取嫩葉提取DNA備用。SRAP引物參照Li等[2]的報(bào)道進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。dNTPs、Taq DNA酶、Buffer等由博彩公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

①茄子DNA提取 隨機(jī)選取各樣本10株，剪取剛展開的新鮮茄子嫩葉20 g，放至液氮中研磨。采用改良的CTAB法提取茄子總DNA[3]，利用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測定OD值，檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量和濃度，使用時(shí)將DNA稀釋到40 ng/L。

②SRAP擴(kuò)增 選擇10條上游引物和10條下游引物，隨機(jī)配成100對引物組合。25 μL反應(yīng)體系為：30 ng/μL DNA 模板，2.0 mmol/L MgCl2，

200 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L 引物，0.75 U Taq酶。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

③PCR產(chǎn)物的檢測 采用1%的瓊脂糖凝膠，恒壓120 V電泳35 min。使用EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物的篩選

利用10條上游引物（Me1～Me10）和10條下游引物（Em1～Em10）組成的100對引物組合對供試材料的混合DNA進(jìn)行擴(kuò)增篩選。結(jié)果表明，大部分SRAP引物均能在250～2 000 bp擴(kuò)增出條帶。選擇條帶清晰并且條帶數(shù)目較多的引物組合對閩茄5號、新組合（06-29×06-16）及各自親本材料進(jìn)行SRAP擴(kuò)增。篩選出1對引物組合（Me5/Em2）擴(kuò)增的閩茄5號譜帶表現(xiàn)為偏父型；1對引物組合（Me3/Em3）擴(kuò)增的新組合（06-29×06-16）譜帶表現(xiàn)為偏父型。

2.2 指紋圖譜的建立

利用篩選出的具有特異性譜帶的引物進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，引物組合Me5/Em2 對閩茄5號擴(kuò)增在1 200 bp具有偏父性條帶（圖1）；引物組合Me3/Em3對新組合（06-29×06-16）擴(kuò)增在460 bp具有偏父性條帶（圖2）。2對引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對閩茄5號及新組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，篩選出Me5/Em2和Me3/Em3分別對閩茄5號及新組合建立指紋圖譜，可以將閩茄5號及新組合很好地區(qū)分開。

SRAP標(biāo)記是顯性標(biāo)記，并且符合孟德爾遺傳規(guī)律，親本所具有的特異性帶能在雜交F1代的譜帶中表現(xiàn)出來[4]，因此，通過檢測F1代帶中是否出現(xiàn)雙親的特異性帶，可以對不同品種進(jìn)行鑒定。在新品種選育過程中，一些優(yōu)勢較強(qiáng)的自交系往往作為母本被重復(fù)利用，因而選育出的新組合與原品種之間具有較高的同源性，用分子標(biāo)記檢測種子純度時(shí)不能選擇母本的特異型條帶，而應(yīng)以父本的特異型帶進(jìn)行篩選。在制種前也可以利用此圖譜作為父本除雜的依據(jù)，提高種子質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳繼兵，林峰，林文.茄子新品種閩茄5號的選育[J].中國蔬菜，2012（24）：99-100.

[2] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103： 455-461.

[3] 王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：742-744.

[4] 郭修武，張鵬翔，郭印山，等.應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定葡萄種間雜交后代[J].分子植物育種，2011（9）：1 389-1 393.endprint