劉璐+趙瑩瑩+張軍東

摘 要 建立了氣相色譜法測定豬凝血酶中磷酸三丁酯殘留量，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。采用聚乙二醇毛細(xì)管柱Agilent HP-INNOWAX（30 m × 250 mm × 0.25 mm），溶劑為正己烷；氣化室溫度190 ℃，分流比1∶1，進(jìn)樣量1 ml；FID檢測器溫度210 ℃；載氣為高純氮?dú)?，流速? ml/min；柱溫150 ℃，運(yùn)行時(shí)間13 min。結(jié)果顯示該方法專屬性強(qiáng)；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為2.406～19.25 mg/ml；低、中、高3個(gè)濃度水平的平均回收率分別為97.1%、101.1%和98.2%，總平均回收率為99.8%，總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%；中間精密度總標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.01%；檢測限為0.762 mg/ml，定量限為2.54 mg/ml；3批樣品的磷酸三丁酯殘留量均低于《中華人民共和國藥典》2015年版三部的限量要求（<10 mg/ml）。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、耐用性良好，可用于豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留檢測。

關(guān)鍵詞 氣相色譜 豬凝血酶 磷酸三丁酯 殘留

中圖分類號(hào)：O657.71； R926 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）21-0076-05

Determination of the residual tri-n-butyl phosphate in porcine thrombin by gas chromatography

LIU Lu*， ZHAO Yingying， ZHANG Jundong

（Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT A gas chromatography method was established to determine the residual Tri-n-butyl phosphate in porcine thrombin and was completely evaluated. An Agilent HP-INNOWAX column （30 m×250 mm×0.25 mm） was adopted and the operation procedures were as follows： vaporizing chamber temperature 190 ℃， split ratio 1：1， sample volume 1 ml； FID detector temperature 210 ℃； carrier gas： highly pure nitrogen at 3 ml/min； column temperature 150 ℃ and running for13 min. The results showed that the method had strong specificity and the standard curve was linear over the range of 2.406～19.246 mg/ml. The average recoveries at low， medium and high levels were 97.1%， 101.1% and 98.2%， respectively and the overall average recovery was 99.8%， and the overall RSD value was 2.37% and RSD value of the mid-precision was 5.01%. The limit of detection was 0.762 mg/ml and the limit of quantitation was 2.54 mg/ml. The residual TNBP values from three batches of porcine thrombin were apparently lower than the limit value set by Chinese Pharmacopoeia （<10 mg/ml）. The method was suitable for the determination of residual TNBP in porcine thrombin with good accuracy， reproducibility， stability and robustness.

KEy WORDS gas chromatography； porcine thrombin； tri-n-butyl phosphate； residue

豬源纖維蛋白黏合劑（含豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應(yīng)的溶解液）原為Ⅲ類醫(yī)療器械，臨床主要用于術(shù)中輔助止血。國家食品藥品監(jiān)督管理總局2006年發(fā)布《關(guān)于規(guī)范纖維蛋白膠類產(chǎn)品監(jiān)督管理有關(guān)事宜的公告》要求豬源纖維蛋白粘合劑類產(chǎn)品由醫(yī)療器械升級(jí)為藥品管理[1]。為提高產(chǎn)品臨床使用的安全性，本公司參照《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[2]在豬凝血酶生產(chǎn)過程中采用有機(jī)溶劑/去污劑（S/D）處理法進(jìn)行病毒滅活，其中有機(jī)溶劑為磷酸三丁酯（tri-n-butyl phosphate，TNBP），研究表明TNBP對(duì)包膜病毒具有較好的滅活效果[3-4]，但對(duì)人體有一定的毒性[5]，故按《中華人民共和國藥典》2015年版三部規(guī)定，磷酸三丁酯殘留量應(yīng)不高于10 mg/ml[6]。本研究采用氣相色譜法對(duì)本公司生產(chǎn)的豬凝血酶進(jìn)行TNBP殘留檢測，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬凝血酶凍干粉（2.5 ml規(guī)格，批號(hào)：20161211、20170114、20170301）由本公司生產(chǎn)。endprint

磷酸三丁酯（GC，純度>99.9%，批號(hào)：BCBN5037V）購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；磷酸三丙酯（GC，純度>99%，批號(hào)：38196TJV）購自美國Sigma-Aldrich公司；正己烷（HPLC，批號(hào)：68977223）購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；高氯酸（AR，批號(hào)：20141025）購自永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；水為純化水。

1.2 主要儀器

安捷倫7890B氣相色譜儀含氫火焰離子化檢測器（FID）（美國安捷倫科技有限公司）；ME104型電子天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；H1650型高速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DKS24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 溶液配制

高氯酸溶液（1.5 mol/L）：量取70%高氯酸溶液12 ml加入裝有約80 ml超純水的100 ml量瓶中，待其溫度降至室溫后，加超純水定容至刻度并混勻。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取磷酸三丙酯0.25 g，加正己烷定容至25 ml，即為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（10 mg/ml）。臨用前取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液0.50 ml于25 ml量瓶中，用正己烷定容即得內(nèi)標(biāo)溶液（200 mg/ml）。

對(duì)照品溶液（STD）：精密稱取磷酸三丁酯0.25 g，加正己烷定容至25 ml，即為對(duì)照品母液（10 mg/ml）。臨用前取對(duì)照品母液0.75 ml于25 ml量瓶中，用正己烷定容即得對(duì)照品溶液（300 mg/ml）。

樣品溶液：每瓶豬凝血酶凍干粉加2.5 ml純化水，待其完全溶解后，即得樣品溶液。

1.4 樣品處理

精密量取樣品溶液1.25 ml于玻璃離心管中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液50 ml和1.5 mol/L高氯酸溶液0.375 ml，混勻，置37 ℃水浴保溫10 min后，加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液進(jìn)樣。

1.5 氣相色譜條件

聚乙二醇毛細(xì)管柱Agilent HP-INNOWAX（30 m ×250 mm × 0.25 mm）；溶劑為正己烷；氣化室溫度190 ℃，分流比1∶1，進(jìn)樣量1 ml；FID檢測器溫度210 ℃；載氣為高純氮?dú)?，流速? ml/min；柱溫150 ℃，運(yùn)行時(shí)間13 min。

1.6 方法驗(yàn)證

1.6.1 專屬性驗(yàn)證

分別取適量內(nèi)標(biāo)（磷酸三丙酯）和對(duì)照品（磷酸三丁酯）用正己烷配制成濃度為5.0 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液和對(duì)照品溶液，按1.5項(xiàng)進(jìn)樣分析，考察方法的專屬性。

1.6.2 線性范圍確定

精密量取對(duì)照品溶液10、20、40、60、80 ml（25%、50%、100%、150%、200%水平），分別置已加1.25 ml水的離心管中，再向各對(duì)照品管精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 ml，混勻，置于37 ℃水浴保溫10 min后，放冷，再加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min后，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液，分別進(jìn)樣上述溶液各一次。以對(duì)照品磷酸三丁酯濃度為x軸，以磷酸三丁酯和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比（As/Ai）為y軸，進(jìn)行線性回歸。

1.6.3 檢測限與定量限確定

檢測限確定：精密量取對(duì)照品母液3 ml置10 ml容量瓶中，正己烷定容至刻度，搖勻，再精密量取該溶液10 ml于加有1.25 ml水的離心管中，再加入50 ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，混勻，置于37 ℃水浴保溫10 min后，放冷，再加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min后，3 000 r/min離心20 min，小心吸取上層正己烷層即得檢測限樣品，按1.5項(xiàng)進(jìn)樣檢測。

定量限確定：精密量取對(duì)照品母液10.0 ml于加有1.25 ml水的離心管中，再加入50 ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，混勻，置于37 ℃水浴保溫10 min后，放冷，再加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min后，3 000 r/min離心20 min，小心吸取上層正己烷層即得定量限樣品，按1.5項(xiàng)進(jìn)樣檢測。

1.6.4 準(zhǔn)確度、精密度（中間精密度）、穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確度驗(yàn)證：分別取對(duì)照品母液20、40 和60 ml于加有1.25 ml樣品溶液的離心管中，按1.4項(xiàng)樣品處理后即得濃度水平為50%、100%、125%的準(zhǔn)確度樣品溶液，每一濃度水平平行配制3份，進(jìn)樣檢測。

精密度驗(yàn)證：采用準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為操作人員甲的精密度（中間精密度）數(shù)據(jù)，操作人員乙在不同的日期、使用不同色譜柱、不同的系列溶液，平行配制6份100%水平準(zhǔn)確度樣品以及2份控制樣品溶液，進(jìn)樣檢測。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液和樣品溶液（100%水平準(zhǔn)確度樣品），分別放置在室溫條件0、12、24和48 h，進(jìn)樣檢測考察溶液穩(wěn)定性。

1.6.5 耐用性試驗(yàn)

在其他色譜條件不變的條件下，方法發(fā)生微小變動(dòng)，分別調(diào)整離心轉(zhuǎn)速至方法規(guī)定的±200 r/min、調(diào)整載氣流速至方法規(guī)定的±0.2 ml/min、調(diào)整柱溫至方法規(guī)定的±2 ℃，考察其系統(tǒng)適應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性

分別取空白溶劑和對(duì)照品溶液（STD）注入氣相色譜儀中分析。結(jié)果表明對(duì)照溶液（STD）中理論板數(shù)按磷酸三丁酯峰計(jì)算均高于5 000；磷酸三丁酯峰與內(nèi)標(biāo)峰的分離度均大于1.5；起始5針對(duì)照溶液（STD）中磷酸三丁酯與內(nèi)標(biāo)峰面積比的RSD均≤5.0%。所有間插進(jìn)樣的對(duì)照品溶液中磷酸三丁酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比與起始5針對(duì)照品溶液的平均峰面積的比值在95.99%～102.7%之間。

2.2 專屬性試驗(yàn)

正己烷對(duì)內(nèi)標(biāo)物和對(duì)照品的保留時(shí)間沒有干擾，專屬性結(jié)果符合接受標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。endprint

2.3 線性試驗(yàn)

線性方程為y = 0.137 4x + 0.015 4，線性范圍為2.406～19.25 mg/ml，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 7，符合接受標(biāo)準(zhǔn)（≥0.990）。

2.4 檢測限與定量限確定

檢測限樣品測得的信噪比（S/N）為5.2，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（S/N≥3），該方法的檢測限為0. 762 mg/ml。定量限樣品6次測得的信噪比（S/N）為15.2～16.8，6份樣品中主成分含量測定結(jié)果的RSD（n=6）為3.56%，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（S/N≥10，RSD 5.0%），該方法的定量限為2.54 mg/ml（表 1）。

2.5 準(zhǔn)確度、精密度（中間精密度）、穩(wěn)定性試驗(yàn)

不同濃度準(zhǔn)確度樣品測得主成分總平均回收率為99.8%，RSD為2.37%（表2）。

精密度樣品檢測結(jié)果顯示兩位操作人員制備的樣品中主成分回收率測定結(jié)果的RSD為5.01%（n=18），結(jié)果滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（15.00%）（表3）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品檢測結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和樣品溶液在不同時(shí)間內(nèi)回收率比值均在 95.0%～105.0%之間（表4）。

2.6 耐用性試驗(yàn)

正常方法與改變參數(shù)方法所得回收率之比應(yīng)在95.0%～105.0%之間。結(jié)果顯示方法發(fā)生微小變動(dòng)后主成分回收率在95.9%～100.9%（表5）。

2.7 樣品檢測

取3批豬凝血酶樣品（20161211、20170114、20170301）按1.4項(xiàng)進(jìn)行樣品處理，進(jìn)樣測定磷酸三丁酯殘留量，檢測結(jié)果分別為0.97、1.46和1.32 mg/ml，均小于方法的定量限（2.54 mg/ml），明顯低于《中華人民共和國藥典》2015年版三部規(guī)定不高于10 mg/ml，磷酸三丁酯殘留量合格。

3 討論

本法所用樣品為每瓶豬凝血酶凍干粉加2.5 ml純化水溶解后所得溶液。因樣品處理步驟較多、用量較大易導(dǎo)致?lián)]發(fā)損失，從而引起較大誤差，因此將樣品取用量減至1.25 ml，同時(shí)將對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)的濃度減半，將高氯酸溶液、正己烷和純化水的體積相應(yīng)減半，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

氣相色譜法已用于多種生物制品中磷酸三丁酯殘留量檢測[5-10]。在樣品處理過程中存在一定的乳化現(xiàn)象，且離心難以完全消除[5，8]，為使樣品離心更完全，本法將樣品混勻后靜置10 min再進(jìn)行離心，有效降低了乳化可能導(dǎo)致對(duì)檢測的不利影響，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在樣品處理過程中，藥典方法[6]以及多項(xiàng)研究[5，9]均采用吸取上層正己烷，用氮吹儀吹掃濃縮再取樣檢測的方法，不僅過程繁瑣且過程難以控制。本研究將空氣流濃縮步驟省略，改為增加進(jìn)樣量直接進(jìn)樣，可簡化實(shí)驗(yàn)步驟而不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)本法參考藥典方法并根據(jù)實(shí)際情況對(duì)色譜條件做了相應(yīng)調(diào)整，以得到更好的峰形和分離度。

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