趙祥穎，張立鶴，韓延雷，楊麗萍，田延軍，劉建軍

(山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南，250013)

葡萄糖對熱帶假絲酵母菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵的影響

趙祥穎*，張立鶴，韓延雷，楊麗萍，田延軍，劉建軍

(山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南，250013)

以熱帶假絲酵母SFX-Y9為研究對象，考察葡萄糖添加對木糖醇發(fā)酵的影響。研究發(fā)現(xiàn)，菌株SFX-Y9以葡萄糖為碳源培養(yǎng)種子，不僅可以提高菌體濃度、縮短培養(yǎng)時(shí)間，而且對木糖的轉(zhuǎn)化基本沒有影響；發(fā)酵培養(yǎng)基中添加少量葡萄糖可以提高木糖消耗速率、縮短發(fā)酵周期。采用5 L發(fā)酵罐通過精準(zhǔn)控制過程溶氧和低流速流加葡萄糖可以進(jìn)一步提高木糖消耗速率，同時(shí)可以提高木糖轉(zhuǎn)化率約15%。在最佳供氧和葡萄糖為輔助碳源的條件下，菌株SFX-Y9木糖醇最大生產(chǎn)速率可達(dá)5.0 g/(L·h)以上，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上，生產(chǎn)成本可以與化學(xué)加氫競爭，具有非常好的工業(yè)開發(fā)應(yīng)用前景。

熱帶假絲酵母；木糖醇；葡萄糖；耗糖速率；轉(zhuǎn)化率

木糖醇是一種五碳的多元醇甜味劑，甜度與蔗糖相當(dāng)，具有抗齲齒、吸濕性好、生物穩(wěn)定性高、甜度與蔗糖相當(dāng)?shù)葍?yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中[1]。同時(shí)，木糖醇在醫(yī)療、制藥、化工、涂料等行業(yè)也有廣泛用途[2]。

木糖醇目前主要是以木糖為原料采用化學(xué)加氫法生產(chǎn)。生產(chǎn)用木糖主要來源于半纖維素水解，如果采用水解液直接加氫，因?yàn)樗庖褐衅渌穷愇镔|(zhì)的存在會(huì)造成木糖醇分離困難。所以，工業(yè)生產(chǎn)一般是先精制木糖，然后以純木糖為原料經(jīng)化學(xué)加氫制備木糖醇?；瘜W(xué)加氫生產(chǎn)木糖醇轉(zhuǎn)化率高、提取收率高，但加氫需要的氫氣為易燃易爆物質(zhì)，廠區(qū)安全級別要求高，具有較大的安全隱患。木糖醇也可以通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，有許多酵母可以轉(zhuǎn)化木糖生成木糖醇。生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，生產(chǎn)過程安全，但生物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率偏低，轉(zhuǎn)化周期長，生產(chǎn)成本與化學(xué)加氫相比沒有競爭力。為了降低原料成本，人們多寄希望于直接采用半纖維素水解液為原料進(jìn)行木糖醇發(fā)酵[3]。半纖維素原料在水解過程中會(huì)產(chǎn)生糠醛、香草醛等對酵母菌體生長有害的化學(xué)物質(zhì)，水解液需經(jīng)預(yù)先脫毒處理才能用于生物轉(zhuǎn)化[4]，并且因?yàn)樵现械钠渌恰⒋汲煞值母蓴_，同樣會(huì)造成后續(xù)木糖醇分離純化困難[5]。因此，采用水解液為原料不但不能降低成本反而會(huì)增加生產(chǎn)成本，用水解液作原料進(jìn)行木糖醇生物轉(zhuǎn)化并不可取[6]。從生產(chǎn)實(shí)際考慮，采用純凈木糖為原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化仍是最佳選擇，但如果和化學(xué)加氫形成競爭力，必須進(jìn)一步提高木糖轉(zhuǎn)化效率，降低原料成本；同時(shí)提高菌株發(fā)酵效率、縮短轉(zhuǎn)化周期，降低轉(zhuǎn)化成本[7]。

酵母轉(zhuǎn)化木糖生成木糖醇的轉(zhuǎn)化率一般只能達(dá)到理論值的65% ～ 85%，主要原因是菌體消耗了一部分木糖醇提供木糖還原所需NADPH。為了提高木糖的轉(zhuǎn)化率，降低木糖的消耗，可以通過添加低成本輔助碳源提供NADPH，提高木糖轉(zhuǎn)化率，葡萄糖是理想的選擇。葡萄糖同化速率快，有利于菌體生長，并且來源豐富、價(jià)格便宜，只有木糖的1/5。但葡萄糖的存在對木糖的利用有阻遏作用[8]，添加葡萄糖可能會(huì)延滯木糖的消耗，從而使發(fā)酵周期延長，同樣會(huì)增加生產(chǎn)成本。

通過添加少量的葡萄糖提高木糖轉(zhuǎn)化率最初是由日本YAHASHI等[9]提出來的。他們通過控制適當(dāng)?shù)钠咸烟菨舛认似咸烟菍δ咎堑淖瓒糇饔?，提高木糖轉(zhuǎn)化率約20%。韓國OH等[10]曾通過流加控制合適的葡萄糖濃度，使木糖轉(zhuǎn)化率得到較大幅度提升，最高達(dá)93%。而VANDESKA[11]等人報(bào)道，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖為木糖的1/10時(shí)，菌體量增加2倍，但木糖醇轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率卻有所降低。KASTNER等研究結(jié)果顯示，添加葡萄糖發(fā)酵過程中會(huì)積累乙醇，反而抑制了菌體的后續(xù)生長降低了轉(zhuǎn)化率[12]。

作者等前期從自然界分離到1株高產(chǎn)木糖醇的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)SFX-Y9[13]，經(jīng)條件優(yōu)化后，木糖消耗速率最高可達(dá)6 g/(L·h)，但轉(zhuǎn)化率卻只有70%左右。本項(xiàng)目以菌株SFX-Y9為研究對象考察葡萄糖添加對木糖醇發(fā)酵的影響，探討利用輔助碳源提高木糖轉(zhuǎn)化效率的可能性。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株candidatropicatisSFX-Y9，山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：木糖(或葡萄糖)50，酵母膏 5，玉米漿 5，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，NaCl 2，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：木糖150～200，酵母膏5，玉米漿 5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 2，KH2PO42，NaCl 2，pH自然。

所有培養(yǎng)基中的木糖均與其他成分分開滅菌。

1.2培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

用接種針從斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8～12 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/500 mL，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2.3 5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)條件

發(fā)酵培養(yǎng)基，初始木糖質(zhì)量濃度約為150 g/L，另外添加10 g/L葡萄糖。接種10%種子液(用50 g/L葡萄糖為碳源的種子培養(yǎng)基，斜面接種后培養(yǎng)8 h)。接種培養(yǎng)4～6 h后開始流加葡萄糖，流加速率為1 g/(L·h)；當(dāng)木糖濃度降至50 g/L左右分兩次補(bǔ)加木糖80 g/L。發(fā)酵過程中，0～8 h控制相對溶解氧濃度為20%～30%，8 h后逐步將相對溶氧水平降至0～5%。發(fā)酵過程中定時(shí)取樣分析木糖、木糖醇、葡萄糖、菌體濃度、pH等參數(shù)。

1.3分析方法

1.3.1 木糖、木糖醇、乙醇定量分析

將發(fā)酵液離心取上清液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，采用HPLC分析木糖、木糖醇、乙醇含量，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

HPLC分析條件：

色譜儀：戴安UV3000，檢測器：示差檢測器，色譜柱：Carbomix Ca-NP5:8%，流動(dòng)相：超純水，流速：0.8mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：80 ℃。

1.3.2 葡萄糖測定

采用SBA-40D葡萄糖測定儀測定。

1.3.3 蛋白含量的測定

參照BRADFORD的考馬斯亮藍(lán)法[14]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 生物量測定

發(fā)酵液稀釋10倍，在600 nm下測定吸光度。

1.3.5 pH值測定

利用PSH-2C精密型酸度計(jì)對發(fā)酵液進(jìn)行測定。

1.4計(jì)算方法

(1)

(2)

2 結(jié)果和討論

2.1葡萄糖對菌株SFX-Y9生長的影響

分別以木糖和葡萄糖為碳源種子培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株SFX-Y9，培養(yǎng)過程中糖的消耗速率與菌體生長曲線如圖1所示。結(jié)果顯示以葡萄糖為碳源SFX-Y9糖消耗速率(圖1-A)和菌體生長速率(圖1-B)明顯比以木糖為碳源快。種齡10 h，葡萄糖為碳源的種子液菌體濃度是木糖的1.45倍，說明SFX-9同化葡萄糖的能力更強(qiáng)，葡萄糖更有利于菌株的生長快，與文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道一致。

圖1 碳源對菌株SFX-Y9底物消耗和生長速率的影響Fig.1 Effect of carbon on the growth of strains SFX-Y9

2.2種子培養(yǎng)基碳源對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵的影響

葡萄糖雖然有利于菌株的生長，但木糖醇發(fā)酵是以木糖為底物轉(zhuǎn)化的，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌種，接種后因?yàn)樘荚吹霓D(zhuǎn)換可能會(huì)造成菌體生長和木糖消耗延滯。分別以葡萄糖和木糖為碳源培養(yǎng)的菌株SFX-Y9種子液，然后接種進(jìn)行木糖醇發(fā)酵，發(fā)酵過程木糖的消耗、木糖醇的積累、菌體生長以及過程pH 變化如圖2所示。

—■—木糖培養(yǎng)菌種 —□—葡萄糖培養(yǎng)菌種(A)木糖消耗；(B)木糖醇的積累；(C)菌體濃度；(D)發(fā)酵液pH圖2 不同種子培養(yǎng)基對菌株SFX-9木糖醇發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different seed media on the xylitol fermentation of SFX-9

從結(jié)果來看，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌種，接種后沒有觀察到菌體生長和木糖消耗的延滯現(xiàn)象?？赡苁且?yàn)槠咸烟菫樘荚捶N子液，菌體濃度比木糖為碳源的高，相對接種量大的原因，接種后木糖的耗糖速率(圖2-A)、菌體生長(圖2-B)、木糖醇生成速率(圖2-C)反而比木糖培養(yǎng)的種子液略快。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌種，不僅生長速度快，并且對木糖醇發(fā)酵也沒有影響，工業(yè)生產(chǎn)中用葡萄糖代替木糖培養(yǎng)菌種可以節(jié)省原料成本。

2.3葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵的影響

酵母轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)木糖醇的代謝機(jī)制為：木糖在木糖還原酶(XR)的作用下以加氫生成木糖醇，木糖醇在木糖醇脫氫酶(XDH)的作用下氧化成木酮糖進(jìn)入磷酸五糖途徑(HMP)[1]。XR輔酶是NADPH，XDH輔酶為NAD+，在限制供氧的條件下，NAD+再生受到限制，抑制了XDH 的活性，從而導(dǎo)致木糖醇積累。酵母轉(zhuǎn)化木糖生成木糖醇的轉(zhuǎn)化率一般只能達(dá)到理論值的65%～85%，主要原因是菌體消耗了一部分木糖醇提供木糖還原所需輔酶NADPH。以葡萄糖為輔助碳源進(jìn)行木糖醇發(fā)酵的目的就是希望菌種可以利用葡萄糖提供輔酶NADPH，減少木糖的消耗。本研究在菌種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察了在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖對菌株SFX-Y9木糖消耗速率和轉(zhuǎn)化率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，葡萄糖添加量在5～30 g/L之間時(shí)木糖消耗速率隨著葡萄糖添加量的增加逐漸加快，當(dāng)葡萄糖添加量增加至40 g/L時(shí)，木糖消耗速率開始出現(xiàn)下降趨勢。研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖最初目的是為了降低木糖消耗，提高木糖/木糖醇轉(zhuǎn)化率，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒有預(yù)期的木糖轉(zhuǎn)化率提高，只有添加量為10～20 g/L時(shí)木糖轉(zhuǎn)化率略有增加。

表1 初始葡萄糖濃度對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵的影響

注：發(fā)酵培養(yǎng)基木糖質(zhì)量濃度按190 g/L配制，不添加葡萄糖實(shí)驗(yàn)組，接種木糖為碳源的種子液，添加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)組，接種葡萄糖為碳源的種子液，接種量均為10%，為了保持接種量一致性，種子液培養(yǎng)時(shí)間略有不同。

為了進(jìn)一步探討葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖消耗的影響機(jī)制，選取30 g/L葡萄糖添加對其發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)分為2組，一組在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30 g/L葡萄糖，對照組不添加葡萄糖，均接種10%葡萄糖為碳源的種子液，實(shí)驗(yàn)發(fā)酵進(jìn)程如圖3所示。

A-木糖消耗；B-木糖醇的積累；C-菌體濃度；D-發(fā)酵液pH圖3 葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵進(jìn)程的影響Fig.3 Effect of glucose on the xylitol fermentation progress of SFX-Y9

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖，發(fā)酵前期菌體生長速率明顯高于對照組，培養(yǎng)前8 h發(fā)酵液的OD比對照組提高30%，培養(yǎng)20 h以后菌體濃度差距縮小，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體濃度差距并不明顯(與表1結(jié)果相似)。培養(yǎng)前8 h，對照組的木糖消耗速率略高于葡萄糖添加組，但8 h以后葡萄糖添加組木糖消耗速率明顯加快，并迅速超過未添加組，最終發(fā)酵周期比對照組縮短8 h以上。添加葡萄糖轉(zhuǎn)化率70.8%，未添加組轉(zhuǎn)化率為69.2%，差距不明顯。所以葡萄糖添加主要作用是促進(jìn)菌體生長，對轉(zhuǎn)化率貢獻(xiàn)率較低。對添加葡萄糖木糖醇發(fā)酵液中有少量乙醇積累(約10 g/L)，而純木糖發(fā)酵發(fā)酵液中基本檢測不到乙醇(圖4)，因此推測菌株SFX-Y9對葡萄糖消耗可能更多是經(jīng)糖酵解途徑，然后進(jìn)一步在乙醇脫氫酶的作用下還原生成乙醇，同時(shí)再生了NAD+，這樣可能促進(jìn)木糖醇的進(jìn)一步代謝，抵消了葡萄糖對轉(zhuǎn)化率的貢獻(xiàn)。

圖4 葡萄糖添加對菌株SFX-9代謝產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of glucose on the products(metabolites)of SFX-Y9

2.4葡萄糖低速流加對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵的影響

搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖的添加雖然可以縮短菌株發(fā)酵周期，但對其木糖轉(zhuǎn)化率增加并不明顯，推測可能是因?yàn)槠咸烟谴x反而激發(fā)了木糖醇的進(jìn)一步消耗造成的。搖瓶發(fā)酵由于條件所限，對過程參數(shù)和底物濃度的控制都不能進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此采用5 L罐發(fā)酵，通過過程參數(shù)的控制和對糖濃度的調(diào)節(jié)，繼續(xù)考察了葡萄糖對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用一次添加葡萄糖的方式進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果與搖瓶培養(yǎng)相似，添加葡萄糖只能縮短發(fā)酵周期，對木糖轉(zhuǎn)化率幾乎沒有貢獻(xiàn)。一次性添加葡萄糖，菌株優(yōu)先利用葡萄糖，木糖消耗受到抑制，菌體葡萄糖和木糖代謝不同步，并且葡萄糖主要通過EMP途徑代謝，對木糖轉(zhuǎn)化率貢獻(xiàn)較低。葡萄糖對木糖的阻遏效應(yīng)當(dāng)葡萄糖濃度低于某一值時(shí)解除，可以實(shí)現(xiàn)木糖和葡萄糖同步利用。通過流加的方式控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度，結(jié)果表明采用低速(1 g/(L·h))流加葡萄糖可以明顯提高木糖的轉(zhuǎn)化率。同時(shí)適當(dāng)降低初始木糖濃度，可以減輕初始糖濃度對菌體生長的抑制。實(shí)驗(yàn)采用初始木糖質(zhì)量濃度為150 g/L，添加10 g/L葡萄糖，發(fā)酵4～6 h后，用每小時(shí)1 g/L的速率流加葡萄糖，當(dāng)發(fā)酵液中木糖濃度降至50 g/L時(shí)，分2次補(bǔ)加木糖80 g/L，發(fā)酵進(jìn)程如圖6所示。發(fā)酵結(jié)果顯示發(fā)酵過程中發(fā)酵液中基本檢測不到葡萄糖，平均木糖消耗速率達(dá)4.0 g/(L·h)以上，最高木糖消耗速率達(dá)7.0 g(L·h)以上，木糖醇平均生產(chǎn)速率達(dá)3.5 g/(L·h)以上，木糖醇最大生產(chǎn)速率可達(dá)5.0 g/(L·h)以上，木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)82.4%，發(fā)酵液中幾乎檢測不到乙醇(圖5)。發(fā)酵過程中共計(jì)流加葡萄糖約40 g/L，對木糖轉(zhuǎn)化率的貢獻(xiàn)約10%。比一次添加葡萄糖發(fā)酵木糖轉(zhuǎn)化率提高約15%。

圖5 低速流加葡萄糖對菌株SFX-Y9代謝產(chǎn)物的影響Fig.5 The products of SFX-Y9 in low speed fed glucose

圖6 5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)程Fig.6 The process of fed-batch fermentation in 5 L fermenter

3 結(jié)論

作者前期分離到1株木糖醇高產(chǎn)菌株SFX-Y9，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化后，木糖消耗速率最高可達(dá)6 g/(L·h)，是1株有工業(yè)應(yīng)用潛力的菌株。文獻(xiàn)報(bào)道采用葡萄糖為輔助碳源可以提高木糖的轉(zhuǎn)化率。本項(xiàng)目研究了葡萄糖對該菌株生長及木糖醇發(fā)酵的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用葡萄糖為碳源種子培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，可以提高菌體濃度，縮短培養(yǎng)時(shí)間，并且對木糖醇發(fā)酵基本沒有影響，完全可以替代木糖用于菌種培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基中添加少量葡萄糖可以縮短發(fā)酵周期10%以上。采用5 L發(fā)酵罐，通過嚴(yán)格控制過程溶氧和采用低流速流加葡萄糖不僅可以進(jìn)一步提高木糖消耗速率，同時(shí)可以提高木糖轉(zhuǎn)化率約15%。綜上，葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖醇發(fā)酵效益的提高還是非常顯著的。在最佳供氧和葡萄糖為輔助碳源的條件下，菌株SFX-Y9木糖醇最大生產(chǎn)速率可達(dá)5.0 g/(L·h)以上，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上，生產(chǎn)成本可以與化學(xué)加氫競爭，具有非常好的工業(yè)開發(fā)應(yīng)用前景。

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EffectofglucoseonxylitolfermentationbyCandidatropicalisSFX-Y9

ZHAO Xiang-ying*, ZHANG Li-he, HAN Yan-lei, YANG Li-ping, TIAN Yan-jun, LIU Jian-jun

(Shandong Provincial Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering, Shandong Food Fermentation Industry Research amp; Design Institute, Jinan 250013,China)

The effects of glucose on xylitol fermentation byCandidatropicalisSFX-Y9 was studied in this paper. Results showed that strains SFX-Y9 with glucose as carbon source to cultivate seeds could shorten training time and improve the concentration of cells, and had little influence upon conversion of xylose. When the fermentation medium was supplemented with a small amount of glucose, it could increase the consumption rate of xylose and shorten the fermentation cycle. Through the control of dissolved oxygen and the glucose fed-batch could further increase the rate of xylose consumption in 5 L fermentor, and the conversion rate of xylose increased by about 15%. Under the condition of optimal oxygen supply and glucose as a secondary carbon source, the production rate of xylitol can reach 5.0 g/(L·h), and the rate of conversion can reach more than 80%. The production cost of xylitol by microbial conversion can compete with the chemical hydrogenation, and it has a bright application future.

Candidatropicalis;xylitol; glucose; sugar consuming rate;yield

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014898

碩士，研究員(趙祥穎研究員為通訊作者,E-mail:xyzhao68@126.com)。

山東省自主創(chuàng)新重大專項(xiàng)(2014XGC07001)

2017-06-07，改回日期：2017-07-18