令狐秀萍，任壽安

miR-21與JNK在間歇性低氧大鼠心肌損害中的作用

令狐秀萍，任壽安

目的通過建立間歇性低氧大鼠模型，觀察間歇性低氧大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并檢測(cè)心肌組織中 miR-21、JNK含量的變化，探討間歇性低氧對(duì)大鼠心肌損害的影響。方法選取健康雄性 SD 大鼠18只，隨機(jī)分 3 組。A組：常氧組(NC)，B組：間歇性低氧 4 周組(CIH4)，C組：間歇性低氧 8 周組(CIH8)，每組6只。將B組、C兩組大鼠放入間歇低氧艙中，分別于 4 周、8 周時(shí)處死，對(duì)大鼠心肌組織進(jìn)行HE染色，觀察各組心肌組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；用PCR法測(cè)定各組心肌組織中miR-21的表達(dá)，用2-ΔΔCT公式計(jì)算miR-21 實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于正常對(duì)照組的變化倍數(shù)，CT (cycle threshold)值表示其表達(dá)量，Western法測(cè)定各組大鼠心肌組織中JNK蛋白的表達(dá)，用灰度值表示其表達(dá)量。結(jié)果對(duì)大鼠心肌組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)B組、C組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分心肌纖維化，且C組更為明顯。B組、C組 miR-21表達(dá)較A組增加，且C組較B組更明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；B組、C組 JNK表達(dá)較A組增加，且C組較B組更明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；將miR-21 與JNK 兩個(gè)指標(biāo)采用 Spearman相關(guān)分析，表明二者具有明顯相關(guān)性。結(jié)論間歇性低氧引起的心肌損害可能是導(dǎo)致大鼠心肌重構(gòu)的誘因之一； miR-21與 JNK 在間歇性低氧大鼠心肌組織中表達(dá)增加，且隨著低氧時(shí)間的延長其表達(dá)量顯著增加，二者可能在間歇性低氧大鼠心肌重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。

心肌重構(gòu)；間歇性低氧；微小RNA-21；c-Jun氨基末端激酶； PCR法；Western法；大鼠

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是睡眠呼吸結(jié)構(gòu)紊亂性疾病的一種，以慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)為特征[1]，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性氧化應(yīng)激，體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)增多，從而引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，ROS還可作為細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控某些基因的表達(dá)等諸多途徑促進(jìn)心肌肥厚、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心室重構(gòu)，繼而出現(xiàn)心功能不全、心力衰竭[2]。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示 OSAHS 在成年男性中發(fā)病率為 2%～4%，女性為 1%～2% ，且發(fā)病率隨年齡增加而增加，65歲以上人群發(fā)病率高達(dá)20%～40%[3]。目前已有對(duì)冠心病病人合并OSAHS的多個(gè)研究提示，夜間睡眠呼吸暫停引起的間歇性低氧與心肌缺血關(guān)系密切[4-5]。

miR-21是一類約由22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA。在正常的心肌中miR-21只有微弱的表達(dá)。但是，在心肌肥大和心臟衰竭時(shí)，miR-21的表達(dá)顯著增加[6-7]。在體和離體研究都表明，miR-21主要來自于心肌組織中成纖維細(xì)胞的表達(dá)，miR-21主要通過調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的增殖而參與心肌纖維化的過程[8]。Thum 等[9]通過原位雜交使miR-21在心臟成纖維細(xì)胞中被上調(diào)，miR-21上調(diào)后抑制軟脂?；椎鞍?(Sprouty1、spry1)的表達(dá)，通過對(duì)spry1的抑制，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/有絲分裂蛋白激酶(ERK/MAPK)通路活性增加，進(jìn)而參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的存活、增殖，抑制其凋亡，進(jìn)而增加了心肌膠原蛋白的分泌，造成心肌成纖維細(xì)胞增殖和心肌纖維化，加重心臟組織的損傷程度。

c- Jun 氨基末端激酶(c- Jun N- terminal kinase，JNK)又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)，是哺乳類細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的一個(gè)亞類。JNK是 1990 年被發(fā)現(xiàn)的促 MAPK 超家族成員之一，屬于進(jìn)化上保守的絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶。JNK蛋白激酶由3個(gè)基因編碼，jnk 1和jnk 2基因在全身廣泛表達(dá)，而jnk 3呈限制性表達(dá)，僅見于腦、心臟和睪丸。JNK基因通過選擇性剪接而產(chǎn)生10種JNK形式，JNK基因編碼的蛋白具有或無-COOH末端，結(jié)果產(chǎn)生46 kDa和54 kDa兩種蛋白。第二種剪接是選擇性編碼JNK功能區(qū)兩個(gè)外顯子中的一個(gè)，但只限于jnk 1和jnk 2基因。不同組織發(fā)出不同指令，通過選擇性剪接，JNK改變停泊位點(diǎn)與底物的結(jié)合能力，從而決定作用底物的特異性[10]。以 JNK 為中心的信號(hào)通路可被細(xì)胞因子、生長因子、應(yīng)激(如電離輻射、滲透壓、熱休克和氧化損傷)等多種因素激活，引起 MAP3Ks 活化，然后激活 MAP2K 異構(gòu)體 MKK4 和 MKK7，然后磷酸化JNK[11]。大量實(shí)驗(yàn)提示 JNK 信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。王玉環(huán)等[12]研究發(fā)現(xiàn)JNKs參與調(diào)節(jié)心肌肥厚。Wang等[13]利用表達(dá)激活的MKK7的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)大鼠的心肌細(xì)胞，使其特異性的激活心肌細(xì)胞JNK信號(hào)通路誘發(fā)了特征性的心肌肥大包括心肌細(xì)胞體積增大、肌小節(jié)重構(gòu)、心房利鈉因子(ANF)表達(dá)增加。

本研究觀察間歇性低氧狀態(tài)下大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的改變以及大鼠心肌細(xì)胞miR-21、JNK含量的表達(dá)，探討間歇性低氧狀態(tài)下心肌重構(gòu)可能的發(fā)生機(jī)制以及miR-21與JNK的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 選取健康 SD 大鼠，隨機(jī)分 3 組。A組：常氧組(NC)，B組：間歇性低氧 4 周組(CIH4)；C組：間歇性低氧 8周組(CIH8)。每組 6 只，每日常規(guī)給予固定量喂食：普通鼠糧20 g/d，分別于4周、8周時(shí)將B組、C組大鼠處死。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 雄性大鼠18只，體重(260±20)g；山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.3 通氣方案 間歇低氧組：將B組、C組大鼠置于上述低氧艙內(nèi)，經(jīng)進(jìn)氣口交替給予 99.9%的氮?dú)馀c99.9%氧氣，將單片機(jī)控制系統(tǒng)的一個(gè)循環(huán)設(shè)定為 110 s，維持低氧艙內(nèi)氧濃度在7%～21%；常氧組：置于與低氧艙同樣大小的設(shè)置進(jìn)出氣口的艙內(nèi)，持續(xù)給予壓縮空氣，維持氧濃度在 21%。該實(shí)驗(yàn)于每日08：00 時(shí)開始、16：00 時(shí)結(jié)束，每日通氣時(shí)間8 h。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)器械及實(shí)驗(yàn)臺(tái) 將烏拉坦按照0.4 mL/kg的標(biāo)準(zhǔn)注入大鼠腹腔進(jìn)行麻醉，隨后將麻醉好的大鼠固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)，沿腹正中線剖開大鼠腹腔至頸部，止血鉗提起大鼠氣管，分離心臟及周圍組織，獲取心臟組織標(biāo)本，解剖完成后使用專用垃圾箱收集大鼠尸體。

1.5 心肌組織HE染色 將適量大鼠左心室組織塊用10%甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋；切片機(jī)將包埋組織標(biāo)本切成約5 μm 厚的石蠟切片；常規(guī)脫蠟→各級(jí)乙醇水洗→蘇木素染色 1 min→自來水沖洗→乙醇分化自來水放置 5 min→伊紅染色 1 min→脫水封片→400×顯微鏡下觀察心肌組織細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 PCR法測(cè)定心肌組織中miR-21的含量

1.6.1 miR-21熒光定量PCR檢測(cè) 利用Primer3.0軟件合成miR-21上游引物tagcttatcagactgatgttga，miR-21下游引物為試劑盒自帶，采用 U6snRNA 為內(nèi)參照基因F：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’、R：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’按以下步驟進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增以檢測(cè)miR-21的表達(dá)量。室溫融化2×miRNA qPCR premix和Reverse primer(10 μM)。將2×miRNA qPCR premix上下顛倒輕輕混勻，過程中避免起泡，經(jīng)短暫離心后使用。將試劑置于冰上，隨后進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

1.6.2 miR-21表達(dá)相對(duì)定量及分析 RT-qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用ABI7300 SDS Software 自動(dòng)分析樣本熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為Ct值。首先計(jì)算各樣本測(cè)定基因miR-21 CT與內(nèi)參照基因U6 CT的差值，即ΔCT=CT(miR-21)-CT(U6)，再用各實(shí)驗(yàn)組樣本的ΔCT 減去正常對(duì)照組樣本的ΔCT，得到ΔΔCT，實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算[1]，表示實(shí)驗(yàn)組測(cè)定基因miR-21的表達(dá)相對(duì)與正常對(duì)照組樣本miR-21表達(dá)的變化倍數(shù)。

1.7 Western法測(cè)定心肌細(xì)胞JNK的表達(dá) 使用石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒提取JNK蛋白，隨后進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL(pierce，KL140454)底物化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)β-Actin，c-JNK，進(jìn)行顯影，定影，并掃描。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 A組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)整、排列有序，未見異常增大的細(xì)胞核，胞漿染色較均勻一致(見圖1)；B組大鼠心肌纖維排列紊亂、粗細(xì)長短不等，心肌細(xì)胞核大小不等、部分消失，胞漿染色不均勻(見圖2)；C組大鼠心肌纖維的長短、粗細(xì)及紊亂程度較B組更明顯，且心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較B組也有明顯改變(見圖3)。

2.2 大鼠心肌組織中miR-21的表達(dá) miR-21的表達(dá)A組小于B組和C組，其中B組又小于C組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.001)。詳見表1。

表1 A組、B組、C組大鼠心肌組織中miR-21表達(dá)結(jié)果(±s)

2.3 大鼠心肌細(xì)胞JNK蛋白的表達(dá) 采用Photoshop7軟件對(duì)JNK蛋白及內(nèi)參β-Actin的電泳圖片進(jìn)行灰度值分析，JNK/β-Actin灰度值的比值為JNK相對(duì)含量，比值越大則表達(dá)越多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為A組小于B組和C組，且B組又小于C組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.001)。詳見表2。

表2 A組、B組、C組大鼠心肌組織中JNK蛋白表達(dá)結(jié)果(±s)

2.4 miR-21與JNK的相關(guān)性分析 通過SPSS20.0 軟件進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析結(jié)果得出P=0.000，相關(guān)系數(shù)為0.794大于0.6，表明miR-21與JNK之間具有強(qiáng)相關(guān)性，miR-21的水平隨著間歇性低氧時(shí)間的延長明顯增高，JNK的表達(dá)也隨之明顯增高。詳見圖4、圖5。

圖4 miR-21溶解曲線

圖5 JNK相對(duì)含量表達(dá)

3 討 論

目前阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的臨床發(fā)病率越來越高，且隨著臨床檢查技術(shù)的發(fā)展其檢出率也逐年提高，人們對(duì)該疾病的重視程度亦有相應(yīng)提高。OSAHS作為一種臨床常見病，主要的臨床表現(xiàn)為睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)的上氣道受阻(完全或非完全性)導(dǎo)致呼吸暫停、低通氣，表現(xiàn)為睡眠過程中間歇性低氧、反復(fù)胸腔負(fù)壓增大、二氧化碳潴留、睡眠質(zhì)量下降，白天嗜睡、記憶力受損及心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)損害。OSAHS區(qū)別于其他呼吸系統(tǒng)疾病的最主要特征即為間歇性低氧，間歇低氧又是通過哪些機(jī)制對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響？目前多數(shù)研究認(rèn)為 OSAHS主要通過氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)以及對(duì)血管內(nèi)皮功能的損害來影響心臟結(jié)構(gòu)及功能[14-15]，進(jìn)而誘發(fā)心血管疾病。Chen等[16]研究大鼠在間歇低氧環(huán)境下暴露5周后的平均動(dòng)脈壓及左心室射血功能變化，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧大鼠平均動(dòng)脈壓升高、左室射血功能降低，提示間歇低氧可能對(duì)大鼠心臟功能產(chǎn)生影響。佟浩等[17]通過對(duì)OSAHS 模型大鼠的左室舒張末壓、左室收縮壓及左室壓力變化最大速率變化研究發(fā)現(xiàn)，間歇低氧可引起左室血流動(dòng)力學(xué)的改變。OSAHS中的反復(fù)間歇性低氧被認(rèn)為是誘發(fā)氧化應(yīng)激的重要因素，氧化應(yīng)激的實(shí)質(zhì)是產(chǎn)生大量的活性氧族(reactive oxygen species，ROS )，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，ROS還可作為細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控某些基因的表達(dá)等諸多途徑促進(jìn)心肌肥厚、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心室重構(gòu)，繼而出現(xiàn)心功能不全、心力衰竭[2]。因此間歇低氧對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響應(yīng)受到足夠的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)間歇性低氧環(huán)境下4周以及8周大鼠的左心室心肌組織HE染色后電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧4周時(shí)大鼠心肌組織即發(fā)生了心肌纖維排列紊亂、粗細(xì)長短不等，心肌細(xì)胞核大小不等、部分消失，胞漿染色不均勻的變化，而間歇性低氧8周組大鼠的心肌組織改變更加明顯，提示間歇性低氧可能引起心肌結(jié)構(gòu)的異常改變。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類由約為22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA。從1993年Lee等[18]發(fā)現(xiàn)第一個(gè)miRNA分子，到2000年Reinhart等[19]發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存于真核生物中，通過調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞和生物體內(nèi)重要的生命活動(dòng)。Corsten等[20]進(jìn)一步進(jìn)行了心臟相關(guān)miR(miR1、miR133a、miR208b、miR499)，纖維化相關(guān)miR(miR21、miR29b)和炎性相關(guān)miR(miR146、miR155、miR223)的研究；另有關(guān)于miR-21通過調(diào)控TGF-β通路，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，增加基質(zhì)沉積，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)心肌纖維化的研究[21]以及Thum 等[9]通過原位雜交研究發(fā)現(xiàn)miR-21在心臟成纖維細(xì)胞中被上調(diào)，miR-21抑制spry1的表達(dá)，通過spry1抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/有絲分裂蛋白激酶(ERK/MAPK)通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的存活、增殖，抑制其凋亡，進(jìn)而增加了心肌膠原蛋白的分泌，造成心肌成纖維細(xì)胞增殖和心肌纖維化，加重心臟組織的損傷程度。結(jié)合上述研究理論基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：通過PCR法分別檢測(cè)常氧組(A組)、間歇性低氧 4 周組(B組)、間歇性低氧 8 周組(C組)心肌組織中miR-21的相對(duì)含量，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)隨著間歇性低氧時(shí)間的延長而明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是1991年發(fā)現(xiàn)的一類絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，MAPK信號(hào)通路被認(rèn)為是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡調(diào)控密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。JNK是MAPK最具特征的亞家族成員之一，亦是機(jī)體應(yīng)激的主要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，可加速細(xì)胞凋亡[22-24]。相關(guān)基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)JNK信號(hào)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化，維持細(xì)胞形態(tài)，構(gòu)建細(xì)胞骨架，并在細(xì)胞凋亡與惡變等多種反應(yīng)，主要通過JNK磷酸化蛋白的表達(dá)來進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)的調(diào)控[25]。多個(gè)研究顯示：JNK的活化參與調(diào)節(jié)心肌肥厚[12]，Wang等[13]研究第一次直接證實(shí)單獨(dú)JNK的活化能充分誘發(fā)特征性的心肌肥大反應(yīng)包括心肌細(xì)胞體積增大、肌小節(jié)重構(gòu)?；钚匝醯纳煽梢曰罨痗-Jun氨基末端激酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及體積增大等心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)[26-27]。本實(shí)驗(yàn)通過使用Western blot法分別檢測(cè)常氧組(A組)、間歇性低氧 4 周組(B組)、間歇性低氧 8 周組(C組)心肌組織中JNK的含量，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，JNK的表達(dá)隨著間歇性低氧時(shí)間的延長而明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-21表達(dá)上調(diào)后抑制spry1的表達(dá)，繼而減少spry1對(duì)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/有絲分裂蛋白激(ERK/MAPK)通路的抑制，ERK/MAPK通路激活調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的存活、增殖，抑制其凋亡，進(jìn)而增加了心肌膠原蛋白的分泌，造成心肌成纖維細(xì)胞增殖和心肌纖維化，在此過程中miR-21與JNK產(chǎn)生相關(guān)性，并通過Spearman分析提示二者具有明顯相關(guān)性。

在間歇性低氧環(huán)境下大鼠模型心肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不等，胞漿染色不均一，心肌纖維排列紊亂、粗細(xì)不等；間歇性低氧環(huán)境下大鼠心肌組織中miR-21與JNK的表達(dá)均增高，且隨著間歇低氧暴露時(shí)間的延長，二者表達(dá)均有顯著增高，提示miR-21與JNK參與低氧所致的心肌重構(gòu)，因二者表達(dá)有明顯相關(guān)性提示可能存在miR-21表達(dá)上調(diào)后激活JNK的表達(dá)增多，進(jìn)而參與心肌重構(gòu)，也可能同時(shí)存在miR-21與JNK通過各自的途徑促進(jìn)心肌重構(gòu)。因該實(shí)驗(yàn)標(biāo)本例數(shù)相對(duì)較少、間歇性低氧時(shí)間相對(duì)較短(最長僅為8周)，若將標(biāo)本例數(shù)增多同時(shí)延長間歇性低氧暴露時(shí)間，miR-21與JNK的表達(dá)是否持續(xù)增高及二者是否仍然具有相關(guān)性則需進(jìn)一步研究。

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2016-05-12)

(本文編輯 王雅潔)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.009

1672-1349(2017)21-2693-05

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原030001)

任壽安，E-mail：renshouan@163.com

信息：令狐秀萍，任壽安.miR-21與JNK在間歇性低氧大鼠心肌損害中的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2693-2697.