李世雨 傅強(qiáng) 嚴(yán)亞賢

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

核酸適配體篩選的改良與優(yōu)化策略

李世雨 傅強(qiáng) 嚴(yán)亞賢

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

核酸適配體以其類似抗體的功能及諸多優(yōu)于抗體的特點(diǎn)引起人們的廣泛關(guān)注，如何利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX技術(shù)）來高效地篩選核酸適配體是其應(yīng)用的關(guān)鍵。結(jié)合近些年核酸適配體的研究進(jìn)展，為提高篩選效率及核酸適配體性能，針對(duì)適配體篩選三大不同環(huán)節(jié)所做的嘗試及改良進(jìn)行相關(guān)的闡述，包括初始隨機(jī)寡核苷酸文庫的設(shè)計(jì)與修飾、篩選過程所用方法及次級(jí)文庫的制備、篩選過程后（Post-SELEX）核酸適配體性能的優(yōu)化等；特別比較了篩選方法包括毛細(xì)管電泳SELEX、細(xì)胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微陣列SELEX和高通量SELEX，以及次級(jí)文庫的制備方法諸如不對(duì)稱PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等長PCR法、綜合性方法等；對(duì)核酸適配體發(fā)展面臨的問題及發(fā)展前景進(jìn)行探討，以期為相關(guān)科研人員的研究提供參考。

核酸適配體；SELEX；篩選效率；優(yōu)化策略

核酸適配體（Aptamer）通常是指在體外利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選得到的核酸（DNA或RNA）片段，它的結(jié)構(gòu)多樣，可形成發(fā)卡、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聯(lián)體等復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，與靶標(biāo)發(fā)生類似抗原-抗體反應(yīng)的構(gòu)象識(shí)別。它因類似抗體的功能，被稱作化學(xué)抗體，且在較高親和力和特異性的基礎(chǔ)上，具有靶標(biāo)范圍廣、篩選周期短、免疫原性低、不依賴動(dòng)物、成本低、易重復(fù)、穩(wěn)定性好、便于合成和修飾等優(yōu)于抗體的特點(diǎn)［1］。核酸適配體發(fā)展?jié)摿薮?，它能否取代抗體一直以來是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。SELEX技術(shù)的目的是在巨大的初始隨機(jī)寡核苷酸文庫中富集到特定靶標(biāo)的親和力高、特異性強(qiáng)的核酸適配體，怎樣快速高效的獲得性能優(yōu)異的核酸適配體是制約其應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵問題之一，本文結(jié)合近些年核酸適配體的研究進(jìn)展，闡述了SELEX技術(shù)不同環(huán)節(jié)涉及到的優(yōu)化改良策略，有助于突破SELEX發(fā)展面臨的篩選效率低的瓶頸，使得越來越多的核酸適配體應(yīng)用到實(shí)際應(yīng)用中去。

1 SELEX技術(shù)的改進(jìn)策略

1.1 初始隨機(jī)寡核苷酸文庫

初始隨機(jī)寡核苷酸文庫是SELEX篩選的起點(diǎn)，對(duì)初始隨機(jī)寡核苷酸文庫進(jìn)行一定的設(shè)計(jì)與修飾可提高核酸適配體的篩選成功率。

1.1.1 初始隨機(jī)寡核苷酸文庫的設(shè)計(jì) 初始隨機(jī)文庫的多樣性是影響SELEX篩選的關(guān)鍵因素之一，而單鏈寡核苷酸的隨機(jī)序列則是文庫多樣性的主要來源［2］。隨機(jī)序列的設(shè)計(jì)常見下列幾種情況：第一種類型最為常見，它的構(gòu)成是A、G、C、T/U四種堿基的平均分布（圖1-A），這樣不僅使得文庫具有最大的多樣性，而且還維持了序列空間與核酸二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的平衡［3］。第二種類型是富含G或G+C的隨機(jī)序列（圖1-B），由于它更易形成G-四聯(lián)體，因而比普通的文庫具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，Choi等［4］利用該類序列篩選到的核酸適配體具有核酸酶抗性及更好的蛋白結(jié)合能力，能被細(xì)胞更好的吸收，并具有選擇性的抗腫瘤增殖活性。第三種類型是部分隨機(jī)化序列（圖1-C），它在隨機(jī)區(qū)域摻入部分已知的對(duì)某靶標(biāo)具有一定結(jié)合能力的序列片段來進(jìn)行再次篩選，Santosh等［5］認(rèn)為這樣可以更快的去發(fā)現(xiàn)新的功能分子；Ahmad等［6］將兩段凝血酶的核酸適配體序列在隨機(jī)區(qū)域組建成的二價(jià)適體，它的親和力相較與單體適體提高了200倍左右，這也為多價(jià)適體或者說多功能適配體的研究提供了方向。第四種類型是特殊設(shè)計(jì)的隨機(jī)序列（圖1-D），它可根據(jù)研究者的特殊研究目的進(jìn)行設(shè)計(jì)，Hao等［7］在隨機(jī)序列中加入一段固定區(qū)域，利用核酸序列與靶標(biāo)作用前后的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換達(dá)到檢驗(yàn)金屬離子Hg2+和Cu2+的目的。

圖1 初始隨機(jī)寡核苷酸文庫的設(shè)計(jì)類型

1.1.2 初始隨機(jī)寡核苷酸文庫的修飾 初始核酸文庫的改良除了可以根據(jù)不同的研究需求進(jìn)行特定的設(shè)計(jì)，還可通過對(duì)核酸文庫進(jìn)行特定的修飾來提高篩選的效率，即通過對(duì)核酸序列中核苷酸的堿基或者骨架進(jìn)行修飾，不僅可以降低核酸酶的易感性，而且能增加核酸的結(jié)構(gòu)多樣性。Yu等［8］篩選到了人凝血酶的TNA核酸適配體，Kd值為200 nmol/Lol/L，其中TNA就是核酸骨架經(jīng)過修飾的異源核酸XNAs中的一種。Kimoto等［9］在初始隨機(jī)文庫中摻入了多達(dá)3個(gè)的Ds核苷酸，其中Ds為攜帶疏水基7-（2-噻吩基）咪唑并［4，5-b］吡啶的非天然核苷酸，利用該特殊修飾的核酸文庫篩選到了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VGF-165和干擾素-λ的核酸適配體，兩者Kd值分別為0.65 pmol/L 和0.038 nmol/Lol/L，親和力比天然核苷酸組成的核酸適配體提高了100多倍。Sefah等［10］以乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）為靶標(biāo)，篩選得到核酸適配體ZAP-2012，其中ZAP-2012是由A、T、G、C四種天然核苷酸及Z、P兩種非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸組合而成，如果將Z、P用天然核苷酸替換，ZAP-2012的親和力會(huì)大幅下降。

1.2 篩選方法

為了提高核酸適配體的篩選效率，篩選方法出現(xiàn)了諸多新的嘗試和改良，這表現(xiàn)在篩選過程的多個(gè)方面。首先，從靶標(biāo)的固定介質(zhì)而言，它的演變就衍生出多種SELEX篩選方法，目前最常用是以磁珠作為靶標(biāo)固定介質(zhì)的磁珠-SELEX。此外，還可以固定核酸文庫或者采用非固定的模式，毛細(xì)管電泳-SELEX就很好的回避了固定方式的問題；細(xì)胞-SELEX甚至可以全細(xì)胞作為靶標(biāo)，很大程度的保留了靶物質(zhì)的天然構(gòu)像。其次，對(duì)核酸文庫的優(yōu)化也是諸多改良中的一種，加尾-SELEX等回避了篩選后需要面對(duì)的截短優(yōu)化等環(huán)節(jié)。隨著篩選效率的不斷提高，微流體-SELEX將基于芯片技術(shù)的篩選平臺(tái)引入到篩選，微陣列-SELEX則可以多項(xiàng)篩選同時(shí)進(jìn)行，篩選自動(dòng)化成為一種新的訴求和發(fā)展趨勢(shì)。最后，相較傳統(tǒng)篩選技術(shù)的盲目重復(fù)，結(jié)合高通量的SELEX對(duì)文庫的富集情況提供了強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支持，在降低了盲目性的同時(shí)也指導(dǎo)了篩選的進(jìn)行，提高了效率。本文將結(jié)合上述嘗試和改良所涉及到的方法做具體介紹。

1.2.1 毛細(xì)管電泳-SELEX 毛細(xì)管電泳-SELEX（Capillary Electrophoresis-SELEX，CE-SELEX） 技術(shù)［11］可直接在溶液中借助毛細(xì)管電泳的高效分離能力將遷移效率不同的物質(zhì)進(jìn)行分離，反應(yīng)體系中的游離核酸與核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的遷移能力不同，借助毛細(xì)管電泳-SELEX技術(shù)可實(shí)現(xiàn)快速分離，從而提高了SELEX的篩選效率。Mendonsa等［12］利用CE-SELEX只需4輪篩選，就得到了IgE的核酸適配體，解離常數(shù)Kd值為40 nmol/Lol/L；Yang等［13］利用CE-SELEX經(jīng)過3輪篩選得到了小分子靶標(biāo)卟啉NMM的核酸適配體。相較于傳統(tǒng)的篩選方法，它們都大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，而且毛細(xì)管電泳裝置進(jìn)樣體積小，節(jié)約了樣本。同時(shí)，基于CESELEX技術(shù)，還有平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳（NECEEM）、Non-SELEX、平衡混合物的平衡毛細(xì)管電泳（ECEEM）、掃集毛細(xì)管電泳（SweepCE）、微流控自由流電泳（μFFE）等多種篩選模式［11］，進(jìn)一步促進(jìn)了CE-SELEX技術(shù)在核酸適配體篩選領(lǐng)域的發(fā)展應(yīng)用。

1.2.2 細(xì)胞-SELEX 核酸適配體的篩選 大多針對(duì)特定的靶標(biāo)展開，細(xì)胞-SELEX（cell-SELEX）是個(gè)例外，它以全細(xì)胞作為靶物質(zhì)，不需要在篩選開始前獲取靶標(biāo)的詳細(xì)情況，這不僅在一定程度上拓寬了SELEX篩選的靶標(biāo)范圍，同時(shí)也挖掘了核酸適配體作為一個(gè)分子工具在疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞分子的識(shí)別、診斷與治療等方面的巨大潛力［14］，使得核酸適配體的研究具有更多實(shí)用價(jià)值。同時(shí)，cell-SELEX以其特有的優(yōu)勢(shì)避免了靶標(biāo)的純化過程，保留了細(xì)胞表面分子的天然構(gòu)象，它涉及到的靶細(xì)胞衍生自各種組織或器官，如心、腦、肺、肝、腎、胰腺、乳腺、卵巢和結(jié)腸等［15］，這對(duì)核酸適配體在相關(guān)疾病的診斷與治療方面意義重大。體內(nèi)SELEX（in vivo SELEX）相較細(xì)胞-SELEX面對(duì)更加復(fù)雜的篩選環(huán)境，它可在活體中篩選核酸適配體，Jing等［16］利用構(gòu)建的肝內(nèi)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移小鼠模型，通過靜脈注射將2'-氟嘧啶修飾的RNA序列文庫注入小鼠體內(nèi)進(jìn)行篩選，得到了RNA解旋酶的核酸適配體。

1.2.3 磁珠-SELEX 將靶標(biāo)固定在固體支持物上是一種比較常見的SELEX篩選方法，隨著SELEX篩選的不斷發(fā)展，固體支持物演變出了諸多種類，如微孔板、親和層析柱、硝酸纖維素膜、表面等離子共振芯片、微流體芯片、瓊脂糖珠、磁珠等；磁珠-SELEX（Mag-SELEX）的優(yōu)勢(shì)在于具有球形的展示面便于靶標(biāo)的充分展示以及較為便捷的磁性分離特性，同時(shí)，各種親和標(biāo)簽與相應(yīng)的親和樹脂（如：組氨酸標(biāo)簽6xHis-與鎳柱瓊脂糖樹脂、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽GST-與谷胱甘肽樹脂、麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽MBP-與直鏈淀粉樹脂）和偶聯(lián)化學(xué)（如氨基、羧基和巰基等）使得該類方法具有廣泛的應(yīng)用范圍［17］。Ye等［18］利用Mag-SELEX 篩選到了氯霉素的核酸適配體。Xu等［19］將熒光標(biāo)記和Mag-SELEX結(jié)合，即利用熒光磁珠（FluMag-SELEX）篩選到了多氯聯(lián)苯的核酸適配體，并利用篩選到的核酸適配體構(gòu)建金納米探針用于檢測(cè)多氯聯(lián)苯，檢出限為0.1-100 ng/mL。對(duì)于不易固定的小分子靶標(biāo)，還可采用固定文庫的方式，即捕獲-SELEX（capture-SELEX），它可將核酸文庫固定到磁珠上用于捕獲易于結(jié)合的靶物質(zhì)；Paniel等［20］設(shè)計(jì)初始文庫時(shí)在單鏈核酸的隨機(jī)區(qū)域引入一個(gè)對(duì)接序列，通過該序列與固定在磁珠上的捕獲核酸以互補(bǔ)配對(duì)的方式將初始文庫固定在磁珠上，通過capture-SELEX的方法篩選到了小分子靶標(biāo)青霉素G的核酸適配體?；贛ag-SELEX及固定文庫的篩選方法，Wang等［21］利用顆粒展示技術(shù)（Particle display），即通過乳化PCR將溶液中的單鏈核酸以105個(gè)拷貝的方式固定展示到每個(gè)磁珠上，然后與熒光標(biāo)記的靶標(biāo)孵育，通過流式細(xì)胞儀逐輪分選出結(jié)合能力強(qiáng)的單鏈核酸。

1.2.4 加尾SELEX 初始文庫中的核酸片段通常是由中間的隨機(jī)區(qū)域，加上兩邊20 nt左右的固定區(qū)組成，加尾SELEX（Tailored SELEX）篩選所用的核酸序列則不含兩邊的固定序列。這一方面降低了固定區(qū)域由于參與隨機(jī)區(qū)域的退火而對(duì)篩選造成的影響；另一方面則是回避了其他SELEX篩選方法需要面對(duì)的篩選后的截短處理等問題。加尾SELEX的具體做法是在隨機(jī)文庫的兩端加上較短的固定序列，它與引物序列通過一段接頭序列連接，經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后，經(jīng)堿裂處理掉兩端序列后即可進(jìn)入下一輪篩選［22］。類似的，基因組SELEX中用于PCR擴(kuò)增的引物序列可能會(huì)與中間的基因組序列配對(duì)，干擾靶標(biāo)與基因組序列的結(jié)合，Wen等結(jié)合加尾SELEX的原理，發(fā)展出了無引物基因組SELEX（primer-free genomic SELEX）［23］；兩種方法可將生物體基因組制成寡核苷酸文庫，從中篩選生物活性分子的天然識(shí)別序列，為研究基因調(diào)控及代謝調(diào)節(jié)提供了新的技術(shù)平臺(tái)［23］。

1.2.5 微流控SELEX 微流控SELEX（Microfluidic SELEX）是將微流控芯片技術(shù)結(jié)合到了核酸適配體的篩選過程中的一種高效、快速的自動(dòng)化篩選方法；它主要包括溶膠-凝膠微流控SELEX（Solgel microfluidic SELEX）和結(jié)合磁珠篩選的微流控SELEX（Magnetic bead-based microfluidic SELEX）。其中，溶膠-凝膠微流控SELEX是將靶標(biāo)包裹在具有納米多孔結(jié)構(gòu)的硅酸鹽玻璃制成的溶膠凝膠中，核酸經(jīng)納米多孔結(jié)構(gòu)擴(kuò)散到達(dá)靶標(biāo)，基于磁珠的微流控SELEX則是將靶標(biāo)固定在磁珠微球上，然后再在微流體芯片上完成富集工作。Bae等［24］利用溶膠-凝膠微流控SELEX經(jīng)過7輪篩選得到了不需經(jīng)化學(xué)修飾的小分子靶標(biāo)黃嘌呤的核酸適配體，Kd值為4.2 μmol/L?；诖胖榈奈⒘骺豐ELEX技術(shù)先后出現(xiàn)了CMACS芯片系統(tǒng)、MMS芯片系統(tǒng)、其中MMS芯片引入了可被外部磁體磁化的鐵磁材料制作的微通道，提高了分離效率，回避了CMACS芯片系統(tǒng)可能會(huì)面臨的芯片通道內(nèi)部微氣泡引起的流體扭曲及磁珠在微通道的堆集等問題。另外，基于MMS系統(tǒng)也出現(xiàn)了很多改良，Wang等［25］在MMS芯片系統(tǒng)上增加了正篩選和負(fù)篩選單元，經(jīng)7輪篩選后得到了肌紅蛋白Myo的核酸適配體，Kd值在4.93 nmol/L和6.38 nmol/L之間；Huang等［26］在MMS芯片基礎(chǔ)上加入了競爭性測(cè)定芯片用于檢測(cè)核酸和靶標(biāo)間的親和力和特異性，并運(yùn)用該系統(tǒng)成功篩選到了甲胎蛋白的核酸適配體，Kd值為2.7 nmol/L。Huang等［27］將篩選涉及的結(jié)合、分離和擴(kuò)增3個(gè)步驟整合到了一個(gè)芯片上，每輪篩選僅需1 h左右，大大提高了篩選的效率。當(dāng)然，微流控SELEX依賴于芯片的集成，而芯片的制作對(duì)專業(yè)性要求較高，這也在一定程度上限制了它的運(yùn)用發(fā)展。

1.2.6 微陣列SELEX 微陣列平臺(tái)可被用于研究基因表達(dá)及蛋白-核酸互作，因此也有研究者將其用于SELEX篩選中來，即微陣列SELEX（Microarray SELEX），它的優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)篩選，大大提高了篩選的效率。Liu等［28］利用蛋白質(zhì)微陣列和微流控芯片結(jié)合的方法，通過將乳鐵蛋白固定在蛋白質(zhì)微陣列芯片上，然后與核酸文庫相互作用，并利用牛血清白蛋白，α-乳清蛋白，β-乳球蛋白，酪蛋白設(shè)置了反篩，通過微陣列掃描儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)富集過程，經(jīng)7輪篩即得到了乳鐵蛋白的核酸適配體，Kd值為1.04 ± 0.50 nmol/L。與大多數(shù)其他SELEX方法（～1016序列）中使用的隨機(jī)庫的大小相比，由于微陣列（＜105序列）的低容量，使用微陣列來進(jìn)行SELEX篩選便受到一定程度的限制。Cho等［29］將微流控技術(shù)、高通量測(cè)序和原位核酸適配體陣列合成技術(shù)三者結(jié)合，構(gòu)建了在篩選的同時(shí)定量測(cè)定核酸適配體親和性和特異性的系統(tǒng)（QPASS），并且利用該系統(tǒng)篩選到了血管生成素Ang2的核酸適配體，Kd值最低在20.5 ± 7.3 nmol/L。

1.2.7 高通量SELEX 傳統(tǒng)的核酸適配體的篩選過程就像一個(gè)黑盒，它是通過重復(fù)的若干輪篩選后，挑取50-100個(gè)單克隆進(jìn)行序列分析，這在一方面會(huì)導(dǎo)致某些高親和力序列的丟失，另一方面，每一輪次級(jí)文庫制備主要依賴于PCR擴(kuò)增，但PCR往往存在偏好性擴(kuò)增的現(xiàn)象，這會(huì)導(dǎo)致初始庫中的低頻高親和力序列隨著篩選的進(jìn)行而不斷丟失，而最后高頻出現(xiàn)的序列也不一定就具有高的親和能力。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)每一輪篩選進(jìn)行高通量的序列測(cè)定和分析，可達(dá)到對(duì)整個(gè)富集過程的監(jiān)測(cè)效果，不僅能及時(shí)的調(diào)整篩選壓力以提高篩選效率，減少篩選的盲目性，而且可以更深層次的解析核酸適配體結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系。Cho等［30］利用微流控SELEX技術(shù)在靶向血小板衍生生長因子（PDGF-BB）的篩選過程中引入高通量測(cè)序技術(shù)，經(jīng)3輪篩選得到Kd值小于3 nmol/L的核酸適配體，親和力比傳統(tǒng)SELEX方法提高了3-8倍，特異性提高了2-4倍。Dausse等［31］利用微流體芯片和表面等離子共振相結(jié)合的方式進(jìn)行靶向X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的SELEX篩選，通過表面等離子共振裝置對(duì)每一輪進(jìn)行親和力進(jìn)行評(píng)估，在第4輪之后觀測(cè)到了表面等離子信號(hào)的明顯變化，最終經(jīng)過六輪篩選得到了XBP1的核酸適配體，Kd值達(dá)8 nmol/L，通過對(duì)第2輪和第4輪進(jìn)行高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)5'-GUUGCGG-3'基序的頻率由4.5%上升至43%，也即在兩輪篩選后，在沒有觀察到表面等離子信號(hào)的變化情況下也能看到富集的趨勢(shì)，加快了篩選的進(jìn)程。

1.3 次級(jí)文庫的制備

單鏈次級(jí)文庫作為每一輪SELEX篩選的起點(diǎn)，如何保證每一輪次及文庫中單鏈核酸的質(zhì)量和產(chǎn)量是核酸適配體篩選成功與否的關(guān)鍵性問題之一。本文主要介紹如下幾種常見的單鏈制備方法：不對(duì)稱PCR法、酶解法、磁珠法、特殊引物結(jié)構(gòu)法及其他一些綜合性方法，并結(jié)合每種方法的自身特點(diǎn)，闡述利弊。

1.3.1 不對(duì)稱PCR制備ssDNA 利用不對(duì)稱PCR制備ssDNA是核酸適配體篩選過程中次級(jí)文庫制備最為常見的方法如圖2所示，它通過控制非限制引物與限制性引物的比例，一般為（50-100）：1，達(dá)到制備ssDNA的目的。不對(duì)稱PCR反應(yīng)擴(kuò)增初期的產(chǎn)物主要是dsDNA，當(dāng)限制性引物用盡之后，非限制性引物引導(dǎo)下的線性擴(kuò)增產(chǎn)物主要為ssDNA，整個(gè)過程中引物的比例至關(guān)重要，需要進(jìn)行相關(guān)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［32］。不對(duì)稱PCR制備單鏈簡易又經(jīng)濟(jì)，但也存如下問題：其一，需要經(jīng)過PAGE膠或者瓊脂糖等手段將ssDNA和dsDNA進(jìn)行分離來保證ssDNA的純度；其二，PCR擴(kuò)增過程會(huì)產(chǎn)生不同類型、不同長度的副產(chǎn)物［33］，隨著篩選的進(jìn)行，需要及時(shí)的優(yōu)化調(diào)整PCR條件才能確保ssDNA的質(zhì)量符合要求。

圖2 不對(duì)稱PCR制備ssDNA的原理圖

1.3.2 λ核酸外切酶法制備ssDNA λ核酸外切酶的最佳作用底物是5'磷酸化的dsDNA，5'磷酸化的dsDNA經(jīng)酶解作用之后就剩下了非磷酸化的單鏈核酸［34］；λ核酸外切酶法制備ssDNA的過程如下（圖3）：首先，利用帶磷酸標(biāo)記的下游引物經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生5'磷酸化的dsDNA；其次，借助λ核酸外切酶催化5'磷酸化的dsDNA，使其反義鏈從5'-磷酸末端逐步放出5'-單核苷酸而被降解掉；最后利用乙醇沉淀等方式將正義鏈回收即為所需的ssDNA。利用λ核酸外切酶法制備ssDNA操作簡便，節(jié)約時(shí)間成本，但是伴隨的酶解不完全等問題也會(huì)影響ssDNA的純度。

圖3 酶切法制備ssDNA的原理圖

1.3.3 磁珠法制備ssDNA 磁珠法制備ssDNA綜合利用了生物素與鏈霉親和素之間較強(qiáng)的非共價(jià)相互作用（解離常數(shù)約為4×10-14M）及磁性微球在磁性環(huán)境下易于操縱的優(yōu)點(diǎn)，磁珠法制備ssDNA的過程如下（圖4）：首先，利用生物素標(biāo)記的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得生物素化的dsDNA；其次，生物素化的dsDNA與鏈霉親和素包被的磁珠在適當(dāng)條件下孵育，形成dsDNA-生物素-鏈霉親和素-磁珠系統(tǒng)；最后在NaOH的作用下，使dsDNA解鏈，不帶生物素的核酸鏈經(jīng)乙醇沉淀回收即為所需的ssDNA。借助磁珠這一介質(zhì)本身的磁性特點(diǎn)，使ssDNA制備過程簡單易行，目前被很多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。但也有報(bào)道稱NaOH可能會(huì)破壞生物素和鏈霉親和素之間的疏水性，范德華力，氫鍵等相互作用，導(dǎo)致生物素標(biāo)記的核酸鏈也解離到溶液中與互補(bǔ)鏈結(jié)合，從而影響單鏈核酸特定三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。為了盡量減少該類情況，需要對(duì)NaOH的用量進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶骄浚?5］。

圖4 磁珠法制備ssDNA的原理圖

1.3.4 不等長PCR法制備ssDNA 不等長PCR法制備ssDNA的實(shí)質(zhì)就是通過特殊設(shè)計(jì)的引物結(jié)構(gòu)來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，造成PCR產(chǎn)物長度上的差異，然后經(jīng)瓊脂糖或者PAGE膠進(jìn)行分離后，切膠回收獲得所需的單鏈核酸，原理如圖5。特殊引物結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)常見有如下兩種：一種是下游引物在與模板的互補(bǔ)序列后面加上六乙二醇的間臂，阻止正義鏈的延伸，同時(shí)在間臂后面加上20個(gè)堿基左右的polyA來增加反義鏈與正義鏈的長度差異［36］；另外一種的下游引物在其模板互補(bǔ)序列的后面加上一段富含GC的區(qū)域，富含GC的區(qū)域具有較高的Tm值，使其在PCR的延伸階段保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而阻止正義鏈的延伸，使得正義鏈和反義鏈間形成長度差異［37］。

圖5 利用特殊引物結(jié)構(gòu)制備ssDNA的原理圖

1.3.5 其他方法 除了上述幾種常見的制備ssDNA的方法，還有一些綜合性的方法被報(bào)道，如利用不對(duì)稱PCR和磁珠法結(jié)合來制備單鏈。該方法流程如圖6。首先，利用對(duì)稱PCR擴(kuò)增得到生物素化的PCR產(chǎn)物；其次，將該生物素化的PCR產(chǎn)物再通過生物素標(biāo)記的引物經(jīng)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物與鏈霉親和素包被的磁珠作用；最后，經(jīng)乙醇沉淀回收即可得到目的ssDNA?；赑CR的單鏈制備過程會(huì)面臨副產(chǎn)物的問題，不同長度的單鏈作為副產(chǎn)物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果但是又很難定量和清除，磁珠法制備單鏈則面臨生物素化單鏈解離等問題。若把這兩種方法結(jié)合起來，能夠很好的回避這兩個(gè)難題［38］。

圖6 利用綜合性方法制備ssDNA的原理圖

2 Post-SELEX

隨著核酸適配體研究的深入，SELEX篩選之后的Post-SELEX階段也越來越受到人們關(guān)注。如果說目前的SELEX篩選過程是一個(gè)“黑盒”，那么Post-SELEX階段就是一個(gè)試錯(cuò)的過程。Post-SELEX主要是對(duì)篩選到的核酸適配體進(jìn)行相關(guān)的修飾改造，以期獲得性能更佳的核酸適配體。Macugen可治療年齡相關(guān)性黃斑變性，也是首個(gè)基于核酸適配體的藥物，它的做法是在鑒定和截短初始適體序列后，對(duì)其尾端做了 2’-O-Me，2’-NH2和 2’-F 等序列修飾，使得最終核酸適配體的親和力、IC50和生物半衰期均提高了數(shù)量級(jí)，進(jìn)而進(jìn)入測(cè)試并被批準(zhǔn)上市［39］。常見的Post-SELEX修飾方法有截短、化學(xué)修飾、重組、定點(diǎn)突變等。截短主要是將一些與靶標(biāo)相互作用不重要的部分移除。Gao等［40］通過對(duì)獲得的漆溝藻毒素的核酸適配體進(jìn)行截短，獲得的核心區(qū)域具有17.7 nmol/L的較低的Kd值?；瘜W(xué)修飾常見于核苷酸的糖環(huán)、堿基及磷酸骨架部位［41］。Lanford等［42］發(fā)現(xiàn)鎖核酸（Locked Nucleic acid）通過與miR-122互補(bǔ)可對(duì)丙型肝炎病毒有效持久的抑制，其中鎖核酸是一種雙環(huán)狀的核苷酸衍生物。Zhang等［43］構(gòu)建多價(jià)核酸適配體的給藥系統(tǒng)，獲得了更強(qiáng)的靶標(biāo)結(jié)合力及細(xì)胞內(nèi)化能力。Zheng 等［44］通過定點(diǎn)突變和優(yōu)化截短將石房蛤毒素核酸適配體的親和力提高了30多倍。

3 展望

核酸適配體作為一種新型分子識(shí)別工具，其在分析檢測(cè)、臨床診斷、疾病靶向治療、新藥研發(fā)、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、生物成像等領(lǐng)域發(fā)展?jié)摿薮?，但SELEX篩選的不同環(huán)節(jié)往往會(huì)遇到不同的問題，這使得目前為止并沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的程序可以適用于各種不同靶標(biāo)，篩選和表征仍是現(xiàn)階段制約核酸適配體應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵問題。本文針對(duì)SELEX篩選的不同環(huán)節(jié)闡述了相應(yīng)的改良與嘗試，相信隨著微流體、微陣列、納米技術(shù)、新型測(cè)序方法及計(jì)算工具等新技術(shù)新方法與SELEX技術(shù)的不斷融合和發(fā)展，核酸適配體的篩選與表征將會(huì)更加的方便快捷，并逐漸走向標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化。另外，針對(duì)目前存在的不足，核酸適配體的研究可以加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究：（1）發(fā)展和完善核酸適配體相關(guān)的數(shù)據(jù)庫信息，將不同領(lǐng)域篩選到的適配體序列信息包括選擇條件、結(jié)構(gòu)特征、親和力、特異性、解離常數(shù)等相關(guān)參數(shù)收集起來，綜合數(shù)據(jù)庫的發(fā)展可以為篩選提供一定的參考和指導(dǎo)；（2）加強(qiáng)核酸適配體與靶標(biāo)互作關(guān)系的研究，找出結(jié)合位點(diǎn)作用機(jī)制，或者結(jié)合不同靶標(biāo)自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)模擬出可能的核酸適配體序列，增大篩選的成功率。

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Improvement and Optimization of Aptamer Selection

LI Shi-yu FU Qiang YAN Ya-xian
（School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Shanghai 200240）

Aptamers have gained extensive attentions due to their similar function as antibody and many superior characteristics，how to use systematic evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX）technology to efficiently screen aptamers is the key to its application.Combined with the research progress of aptamers in recent years，the article introduces optimization strategies for increasing the screening efficiency in three different stages of the screening process，including the design and modification of the initial random oligonucleotide library before SELEX，the selection method and generation of ssDNA library during SELEX，and the optimization of aptamer performance after SELEX（Post-SELEX）. Especially，the article compares many screening methods including capillary electrophoresis-SELEX，cell-SELEX，magnetic beads based-SELEX，tailored SELEX，microfluidic SELEX，microarray SELEX，and high-throughput SELE，as well as the methods for the generation of ssDNA such as asymmetric PCR，λ exonuclease digestion，magnetic beads-based separation，unequal length PCR，and some comprehensive methods. Also we explore the issues and prospects of the development of aptamers，providing references for related researchers.

aptamer；SELEX；screening efficiency；optimization strategy

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0469

2017-06-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571932）

李世雨，女，碩士，研究方向：核酸適配體檢測(cè)；E-mail：muyangshaonian@sjtu.edu.cn

嚴(yán)亞賢，女，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)與免疫學(xué)；E-mail：yanyaxian@sjtu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李楠）