王偉偉 劉妮 陸沁 凌曉霏 陳航，2

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；2. 國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

RNAi技術(shù)的最新研究進(jìn)展

王偉偉1劉妮1陸沁1凌曉霏1陳航1，2

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；2. 國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物中由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)同源mRNA降解，使靶基因沉默的現(xiàn)象。目前，RNAi技術(shù)作為基因調(diào)控的有效工具，具有高度特異性、高效、可傳播等特點(diǎn)，被廣泛用于病蟲害防治、腫瘤及癌癥治療等領(lǐng)域。尤其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，相對于傳統(tǒng)的疫苗預(yù)防和藥物治療而言，RNAi技術(shù)在靶點(diǎn)用藥、減少副作用、抑制致病基因表達(dá)等方面具有不可比擬的優(yōu)越性，在癌癥等疾病治療的新方法中發(fā)揮越來越重要的作用。主要介紹RNAi的作用機(jī)理、導(dǎo)入方法及其在植物改良、生物防治、昆蟲抗藥性、疾病的預(yù)防與治療中的最新應(yīng)用進(jìn)展，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行綜合分析與評價(jià)，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供參考。

RNAi；dsRNA；shRNA；轉(zhuǎn)基因法；作用機(jī)理

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在真核生物中，由雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)同源mRNA降解，使靶基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象［1］。1998年，F(xiàn)ire等［2］用 dsRNA沉默秀麗隱桿線蟲中相應(yīng)的mRNA，闡述了基因沉默現(xiàn)象的本質(zhì)，并將其特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默的這一現(xiàn)象稱為 RNA干 擾。2000年，Wianny和 Svoboda等［3-4］先后發(fā)現(xiàn)在小鼠的胚胎細(xì)胞和卵母細(xì)胞中dsRNA能引發(fā)RNAi效應(yīng)。2002年，Brummelkamp等［5］在小鼠體內(nèi)構(gòu)建表達(dá)載體pSUPER，使用該載體能持續(xù)抑制目的基因表達(dá)，為RNAi技術(shù)在基因治療方面奠定基礎(chǔ)。RNAi為人們了解生命提供了新視角，并為醫(yī)學(xué)發(fā)展提供了新工具，2006年Craig Mello 和Andrew Fire由于在RNAi機(jī)制研究中所作出的貢獻(xiàn)，獲得諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎。本文針對RNAi的作用機(jī)理、導(dǎo)入方法及其在植物改良、生物防治、昆蟲抗藥性、疾病的預(yù)防與治療中的最新應(yīng)用進(jìn)展做較為詳盡的綜述，旨為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供參考。

1 RNAi的作用機(jī)理及特點(diǎn)

1.1 RNAi的作用機(jī)理

RNAi的作用過程分為起始、效應(yīng)、擴(kuò)增3個(gè)階段（圖1）。（1）起始階段：加入的dsRNA被Dicer酶切割為21-23 nt大小的siRNA片段；（2）效應(yīng)階段：siRNA雙鏈在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。解旋酶將siRNA雙鏈解旋為單鏈，單鏈中的引導(dǎo)鏈（Guide strand）與靶mRNA通過堿基互補(bǔ)配對而結(jié)合，在ATP供能的情況下，RISC中核酸內(nèi)切酶slicer切割靶mRNA，將mRNA切割降解，阻止其翻譯，引起靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的沉默［6］；（3）擴(kuò)增階段：siRNA與mRNA結(jié)合，并作為引物，在RNA聚合酶（RdRp）作用下再次形成dsRNA，然后重復(fù)起始階段和效應(yīng)階段，從而進(jìn)一步放大RNAi的作用，最終將靶mRNA完全降解。

圖1 RNAi的作用機(jī)理［7］

1.2 RNAi技術(shù)的特點(diǎn)

1.2.1 高效性 細(xì)胞內(nèi)的RNAi途徑存在級聯(lián)放大效應(yīng)，極少量的dsRNA經(jīng)起始階段—效應(yīng)階段—擴(kuò)增階段的循環(huán)就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)，以維持高效的干擾作用。

1.2.2 特異性 RNAi只特異地降解同源mRNA，而其他mRNA表達(dá)則不受影響，從而準(zhǔn)確沉默目的基因。

1.2.3 位置效應(yīng) Holen 等［8］根據(jù) TF（Tissue factor）不同位置的dsRNA對基因沉默效率的影響，結(jié)果表明dsRNA對mRNA的結(jié)合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。

1.2.4 ATP依賴性 RNAi是一個(gè)ATP依賴的過程，在沒有ATP時(shí)發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象降低或消失，可能是由于在Dicer和RISC的酶切反應(yīng)過程中必須要ATP提供能量［9］。

1.2.5 可傳播性 可以跨越細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞甚至生物體間長距離傳遞和維持，使RNAi擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并可傳遞給子代［10］。

2 RNAi的方法

RNAi有注射、喂食、浸泡、病毒感染、轉(zhuǎn)基因等方法（表1），較常用注射法、喂食法和浸泡法。在RNA干擾研究的初期，注射最初主要應(yīng)用于線蟲［2］；隨著在果蠅中運(yùn)用的開展［11］，其逐漸成成為有效引入dsRNA的方法之一。目前已在煙草天蛾（Manduca sexta）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）等研究對象中建立了注射dsRNA誘導(dǎo)RNAi的體系，此方法通過將dsRNA或siRNA注射到昆蟲或其他研究對象的特定部位，迅速到達(dá)靶位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)其作用的快速性與高效性。但當(dāng)研究對象個(gè)體過小時(shí)，注射難度增大且成活率降低的問題仍無法解決。由于操作帶來的局限性，使其很難用于大規(guī)模分析。喂食法最早應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲，用含有dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲后，其表現(xiàn)為部分功能缺失或產(chǎn)生突變體的表型［12］，喂食法由此成為RNAi中有效引入dsRNA的另一手段。目前主要應(yīng)用的喂食法有3種：第1種是細(xì)菌喂食法，在細(xì)菌中表達(dá)dsRNA，通過喂食細(xì)菌來實(shí)現(xiàn)；第2種是直接喂食法，在體外合成dsRNA，并將dsRNA混入食物或溶液中直接喂食。這種喂食法在馬鈴薯甲蟲中得到了成功應(yīng)用［13］，但在果蠅實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該方法并不能使果蠅引起RNAi［14］；第3種手段是通過表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，將昆蟲基因作為靶標(biāo)，提高植物的抗蟲性［15］。研究發(fā)現(xiàn)，利用此方法可使馬鈴薯中的葉綠體產(chǎn)生大量的馬鈴薯甲蟲β-actin基因的dsRNA，從而代替化學(xué)殺蟲劑，使取食馬鈴薯葉片的馬鈴薯甲蟲在幼蟲時(shí)期死亡［16］。喂食誘導(dǎo)RNAi因其操作簡單方便，對研究對象危害性小等特點(diǎn)，可大量用于高通量的基因?qū)嶒?yàn)。但喂食法均存在作用較慢、效率較低的缺點(diǎn)。近年來，在RNAi實(shí)驗(yàn)中，將材料直接浸泡在dsRNA溶液中，因其操作簡便，周期短而得到廣泛應(yīng)用，也稱其為細(xì)胞外RNA干擾［17］。2000年，Clemens等［18］第一次利用果蠅胚胎的S2細(xì)胞進(jìn)行了浸泡實(shí)驗(yàn)并取得成功，目前浸泡法在雙翅目的黑腹果蠅和鱗翅目的家蠶中成功率比較高。

表1 dsRNA不同轉(zhuǎn)運(yùn)方式優(yōu)缺點(diǎn)比較［17，19］

3 RNAi技術(shù)的應(yīng)用

3.1 RNAi技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1.1 植物改良中的應(yīng)用 通過RNAi技術(shù)對植物抗逆相關(guān)基因挖掘及功能的研究，對于培育具有較強(qiáng)抗逆性的植物新品系至關(guān)重要。高夢燭等［20］通過構(gòu)建RNAi膜蛋白（Putative membrane related protein，PMRP）載體，將PMRP-RNAi載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因擬南芥；用于分析PMRP對擬南芥抗寒性的影響，結(jié)果表明PMRP表達(dá)量降低可增強(qiáng)擬南芥的抗寒性，為增強(qiáng)作物抗逆性提供理論依據(jù)。NAC蛋白在植物適應(yīng)環(huán)境和抵御逆境脅迫中起重要作用，2017年，Wang等［21］對剛毛檉柳Tamarix hispid的NAC型轉(zhuǎn)錄因子ThNAC13在鹽和滲透脅迫的反應(yīng)進(jìn)行了功能分析，通過RNAi技術(shù)沉默ThNAC13發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳對鹽和滲透脅迫的耐受性降低。結(jié)果表明，ThNAC13是遺傳育種中增強(qiáng)鹽和滲透脅迫耐受性的重要基因。利用RNAi篩選與抗逆性相關(guān)的基因，從而改良植物使其具有抗寒、抗鹽脅迫等抗性，將有利于植株在逆境中生存。

3.1.2 生物防治中的應(yīng)用 害蟲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失，是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要因素之一，生物防治作為高效且無污染的方法逐漸成為最理想的防治手段。在生物防治領(lǐng)域，RNAi技術(shù)有廣泛的應(yīng)用前景，其對害蟲控制策略在于選擇合適的靶基因。近幾年來，隨著RNAi技術(shù)的發(fā)展，對未知基因功能的研究越來越多，在害蟲防治中也發(fā)現(xiàn)了一些合適的靶基因。2015年，Xu等［22］在對稻飛虱長短翅的研究中發(fā)現(xiàn)，以褐飛虱Nilaparvata lugens為模型，褐飛虱兩個(gè)同源性極高的胰島素受體InR1和InR2在長、短翅分化中起著決定性作用。當(dāng)利用RNAi技術(shù)沉默InR2使其含量降低時(shí)，長翼變形，這對開發(fā)新型褐飛虱治理技術(shù)具有重要價(jià)值，也可為其他害蟲的防治提供新的策略。海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）在昆蟲發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，2016年，Tang等［23］對赤擬谷盜Tribolium castaneum中與幾丁質(zhì)相關(guān)的5種海藻糖酶基因的功能研究發(fā)現(xiàn)，在用RNAi技術(shù)沉默這5種基因時(shí)，觀察到有異常表型出現(xiàn)，赤擬谷盜的死亡率在17%-42%之間，結(jié)果表明通過沉默海藻糖酶基因來調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而使其蛻皮畸形和產(chǎn)生高的死亡率。2017年，Yang等［24］利用RNAi技術(shù)將褐飛虱Nilaparvata lugens體內(nèi)的海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1和TPS2敲除，褐飛虱出現(xiàn)異常表型，有30%的昆蟲死亡。通過數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）分析顯示，TPS基因的沉默可導(dǎo)致蛻皮畸形，并參與甲殼素代謝基因的調(diào)控，他們認(rèn)為TPS基因在未來是潛在的害蟲控制目標(biāo)。

RNAi技術(shù)在病害防治中也有廣泛的應(yīng)用。番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是危害番木瓜生產(chǎn)的致命性病原，并制約番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2017年，黃靜等［25］為了培育出對海南地區(qū)PRSV種群具特異抗性的番木瓜新品種，根據(jù)RNAi原理構(gòu)建抗PRSV表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-CPRNAi-OCS，將載體導(dǎo)入番木瓜的愈傷組織中，通過抗病毒試驗(yàn)分析表明，轉(zhuǎn)基因株系474和非轉(zhuǎn)基因株系1280相比對PRSV有較好抗性，但要獲得廣譜抗PRSV的植株還有待于進(jìn)一步田間試驗(yàn)。白粉病是限制瓜葉菊生產(chǎn)和推廣的主要病害，王丹等［26］構(gòu)建了Mlo基因的RNAi載體質(zhì)粒Ptck303-Mlo-RNAi，構(gòu)建了瓜葉菊‘大花’高頻再生體系。并導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中進(jìn)行瓜葉菊的遺傳轉(zhuǎn)化，為培育抗白粉病的瓜葉菊新品系奠定基礎(chǔ)。

3.1.3 昆蟲抗藥性中的應(yīng)用 隨著化學(xué)殺蟲劑大范圍、大劑量重復(fù)使用，一些害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生很強(qiáng)抗性，深入探究昆蟲抗性機(jī)理，有助于抗性的有效治理，RNAi技術(shù)為害蟲抗藥性機(jī)理的研究提供了有效途徑。2014年，Hu等［27］經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450基因家族中CYP321E1在抗藥性中起的作用很大，對此，研究人員利用RNAi技術(shù)，將dsRNA通過注射輸送到小菜蛾P(guān)lutella xyllostella體內(nèi)，從而降低CYP321E1基因的表達(dá)，經(jīng)過24 h觀察發(fā)現(xiàn)小菜蛾幼蟲死亡率增加，這將為解決昆蟲對抗藥性的難題提供新的思路。2015年，Guo等［28］對小菜蛾P(guān)lutella xyllostella抗藥性的研究表明，利用RNAi技術(shù)沉默ABCG亞家族的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，能使小菜蛾幼蟲對CryiAc毒素的敏感性降低，從而對小菜蛾抗藥性有一定的作用。

3.2 RNAi技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.2.1 疾病預(yù)防中的應(yīng)用 肉類安全問題一直受到社會各界的廣泛關(guān)注，其中牲畜疾病是嚴(yán)重威脅肉類安全的主要因素，因此對動物疾病的預(yù)防備受關(guān)注。RNAi技術(shù)在疾病預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用，如在口蹄疫（FMD）的預(yù)防和流感病毒（H1N1）的控制中都有相關(guān)研究。2014年，Li等［29］通過siRNA產(chǎn)生對PRRSV特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因（TG）豬，經(jīng)過TG豬與NTG對照發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)siRNA表達(dá)使豬血清HP-PRRSV含量顯著降低，并且增加了3 d的存活時(shí)間，RNAi技術(shù)為家畜抵抗病毒感染提供可能性。2016年，Linke等［30］針對禽流感病毒（AIV）的核蛋白（NP）和聚合酶酸性蛋白（PA），利用siRNA細(xì)菌載體遞送到禽黏膜上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種新型抗AIV載體能夠抑制AIV并將病毒滴度降低10 000倍。siRNA載體技術(shù)可作為一種新型的抗病毒方法，用于禽流感、人類流感的抗病毒技術(shù)和基于RNAi的載體的其他病毒。

3.2.2 疾病治療中的應(yīng)用 在傳統(tǒng)的腫瘤和癌癥治療中，多應(yīng)用化療法來有效的殺死腫瘤和癌癥細(xì)胞，但其作用于腫瘤和癌細(xì)胞的同時(shí)也對正常細(xì)胞產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞死亡。利用RNAi技術(shù)對靶位點(diǎn)局部用藥，盡量減少用藥給機(jī)體帶來的副作用，是腫瘤和癌癥治療的重要發(fā)展方向。2016年，Wu等［31］利用 RNAi沉默 PIK3CA和PIK3CB基因來抑制人類結(jié)腸直腸癌（CRC）組織中的致瘤性，結(jié)果表明PIK3CA和PIK3CB可以作為結(jié)腸直腸癌的潛在治療藥物靶點(diǎn)，對CRC患者提供個(gè)性化治療方案并能夠緩解癌細(xì)胞在化療時(shí)的抗性。埃-巴病毒（EBV）引起的胃癌（EBVaGC）作為惡性腫瘤最常見的胃癌（GC）之一，通過傳統(tǒng)方法如手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等很難完全清除腫瘤細(xì)胞。2017年，Wang等［32］應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制EBV陽性胃癌GT38細(xì)胞系中的潛伏膜蛋白2A（LMP2A）基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖被顯著抑制，凋亡率增加。因此，LMP2A將是EBVaGC治療的潛在靶標(biāo)，可作為開發(fā)抑制腫瘤細(xì)胞生長或治療EBVaGC的新方法。

RNAi技術(shù)可抑制致病基因的表達(dá)，用于治療癌癥和其他疾病是一種極為有效的策略，但面對大多數(shù)疾病，如何將干擾載體高效率、安全的運(yùn)送到靶位點(diǎn)還是一個(gè)挑戰(zhàn)。2015年，Weinstein等［33］在對一種侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤（MCL）的研究中發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞周期蛋白D1過表達(dá)，他們設(shè)計(jì)了涂有抗CD38單克隆抗體的脂質(zhì)基納米粒子（LNP），該抗體被人為的使MCL細(xì)胞吸收并異種移植到小鼠的骨髓中，利用RNAi技術(shù)可使LNP誘導(dǎo)MCL細(xì)胞中的基因沉默，細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)下降，并能延長帶病小鼠的存活時(shí)間，從而獲得一種新的RNAi遞送系統(tǒng)。2015年，Cohen等［34］在對多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）的研究中，利用RNAi技術(shù)使透明質(zhì)酸（HA）移植的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）直接到GBM位點(diǎn)。在小鼠實(shí)驗(yàn)中可使mRNA水平降低80%以上，對于腫瘤的治療的遞藥系統(tǒng)提供新的思路。

4 結(jié)語

基因測序技術(shù)的發(fā)展為我們獲取大量的基因信息提供了技術(shù)保障，RNAi作為一種對基因表達(dá)具有特異性的抑制機(jī)制，為未知基因功能的研究提供了技術(shù)平臺，成為研究基因功能的最有利的工具。同時(shí)RNAi技術(shù)具有簡單、快速、重復(fù)性好等特性，可成為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的新策略。此外，RNAi可抵抗病毒入侵、防止突變基因過量增殖等作用，可成為開展基因治療的新途徑。

目前，RNAi技術(shù)以快速、可靠、操作簡單的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在植物改良、生物防治、疾病預(yù)防和治療等領(lǐng)域，雖在實(shí)驗(yàn)室條件下取得初步成果，但在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題。如siRNA不僅可與靶基因特異性結(jié)合，也可與非靶基因結(jié)合使其基因沉默，出現(xiàn)脫靶效應(yīng)（Off-target effect）［35］。脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生嚴(yán)重影響RNAi應(yīng)用，已成為RNAi技術(shù)從實(shí)驗(yàn)到臨床轉(zhuǎn)化過程中面臨的一個(gè)重要問題。然而隨著高通量測序和轉(zhuǎn)錄組的發(fā)展，篩選出合適的靶基因并對特定的靶基因用藥將可有效解決脫靶問題。還有如何提高靶基因的沉默效率有待于研究，可將dsRNA進(jìn)行特定的包裝和修飾，讓靶基因更好的吸收，從而提高靶基因的沉默效率。

隨著對分子生物學(xué)研究的不斷深入，RNAi技術(shù)作為一種新的基因阻斷技術(shù)，必將從實(shí)驗(yàn)階段走向?qū)嶋H應(yīng)用，在功能基因研究、基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制、植物改良、病害蟲防治和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的基因治療、耐藥物細(xì)胞模型的建立和篩選、新藥開發(fā)等方面將有廣泛的發(fā)展前景。

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Latest Research Progress on RNA Interference Technology

WANG Wei-wei1LIU Ni1LU Qin1LING Xiao-fei1CHEN Hang1，2
（1. Research Institute of Resources Insects，Chinese Academy of Forestry，Kunming 650224 ；2. Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects，State Forestry Administration，Kunming 650224）

RNA interference（RNAi）is a phenomenon in which the target gene is silenced by double-stranded RNA（dsRNA）inducing homologous mRNA degradation in the eukaryotic cells. At present，RNAi technology，as an effective tool for gene regulation，is widely used in pest control，cure of tumor and cancer duo to its high specificity，high efficiency，transmission and other characteristics.Especially in the medical application，compared with the traditional vaccine prevention and drug therapy，RNAi technology has unparalleled advantages of target medication，reducing side effects and inhibiting the expression of virulence genes，thus it plays an increasing significant role in the new treatment methods of cancer and other diseases. The mechanism，introducing methods of RNAi and its latest application in plant improvement，biological control，insect resistance，disease prevention and treatment are synthetically analyzed and evaluated in this paper，for providing the reference for researchers in related fields.

RNAi；dsRNA；shRNA；transgenic method；action mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0455

2017-06-02

國家林業(yè)局948 項(xiàng)目（2014-4-66），中央級公益性科研院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CAFYBB2014ZD005）

王偉偉，男，碩士研究生，研究方向：資源昆蟲分子生態(tài)；E-mail：sk121www@163.com

陳航，男，博士，研究員，研究方向：資源昆蟲學(xué)；E-mail：stuchen6481@gmail.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）