符金華， 楊琳芬*， 董澤民， 徐國茂， 姜文娟 ， 邢 磊，黃艷清， 李瑾瑾， 周仁丹， 葉 金， 吳 宇， 廖 豐

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330029；2.南昌大學(xué)分析測(cè)試中心，江西南昌 330047；3.國家糧食局科學(xué)研究院，北京西城，100037；4.雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司，江西南昌 330096）

飼料中16種霉菌毒素液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法的條件優(yōu)化

符金華1， 楊琳芬1*， 董澤民1， 徐國茂1， 姜文娟1， 邢 磊1，黃艷清1， 李瑾瑾1， 周仁丹2， 葉 金3， 吳 宇3， 廖 豐4

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330029；2.南昌大學(xué)分析測(cè)試中心，江西南昌 330047；3.國家糧食局科學(xué)研究院，北京西城，100037；4.雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司，江西南昌 330096）

本文優(yōu)化并建立了飼料中16種霉菌毒素的多殘留提取、凈化及液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-LC-MS/MS）的檢測(cè)方法。 樣品經(jīng) 20 mL 乙腈/水/乙酸（V∶V∶V，70∶29∶1）溶液提取、稀釋和上機(jī)檢測(cè)。 采用 0.1%甲酸的1 mmol/L NH4Ac的水相作為弱洗脫流動(dòng)相梯度洗脫程序，離子源溫度為500℃，采用分段MRM掃描模式，100 ms的駐留時(shí)間，16種霉菌毒素分離理想、基線平穩(wěn)、選擇離子信號(hào)強(qiáng)度高、干擾離子信號(hào)弱；同時(shí)，得到了與理論計(jì)算值非常接近的所有選擇離子精確質(zhì)量數(shù)。完成了16種毒素的Qtrap-LC-MS/MS方法條件優(yōu)化，成功的實(shí)現(xiàn)飼料中16種霉菌毒素的快速定性、定量分析。

霉菌毒素；液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法；同位素內(nèi)標(biāo)；優(yōu)化

霉菌毒素是產(chǎn)毒真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可導(dǎo)致人類和動(dòng)物急慢性中毒，具有致癌、致畸、致突變作用（朱聰英等，2010）。研究表明，飼料及其原料易被各種霉菌毒素污染（Binder等，2007），從而降低飼料的口感與質(zhì)量，甚至導(dǎo)致動(dòng)物中毒，給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品安全造成極大的危害，更為嚴(yán)重的是部分毒素可進(jìn)入食物鏈威脅人類健康。其中，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)影響較大的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮等（Marin 等，2013；鄭翠梅等，2012）。

然而，飼料中毒素的含量很低，且基質(zhì)干擾嚴(yán)重，這對(duì)霉菌毒素進(jìn)行準(zhǔn)確快速定性和定量的檢測(cè)方法是巨大的挑戰(zhàn)。目前，有關(guān)霉菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法 （TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）等（朱聰英等，2010；魏麗莉等，2008；Chiar等，2007；鮑蕾等，2005）。 在一定程度上，這些方法能夠滿足目前部分毒素的檢測(cè)，但也存在諸多問題，如TLC法的穩(wěn)定性和重復(fù)性差，易受外界環(huán)境的干擾；ELISA法通常作為篩選方法，不能準(zhǔn)確定量，且易出現(xiàn)假陽性；HPLC法容易受到基質(zhì)干擾，且部分毒素的檢測(cè)限達(dá)不到限量標(biāo)準(zhǔn)要求；GC-MS法的操作步驟繁瑣，衍生化的效率低等。另外，在實(shí)際的飼料樣品中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素同時(shí)污染（Monbaliu等，2009），而這些方法只能對(duì)一種或結(jié)構(gòu)類似的毒素進(jìn)行檢測(cè)。

因此，開發(fā)同時(shí)檢測(cè)飼料中常見的多種霉菌毒素方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）是一種集高效分離和多組分同時(shí)定性、定量于一體的檢測(cè)技術(shù)，具有較強(qiáng)抗基體干擾、高通量、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，成為近年來痕量檢測(cè)中發(fā)展非?？斓男录夹g(shù)之一 （Markus 等，2012；Johannes 等，2012；Mira 等，2010；Micheal等，2009）， 目前大多數(shù)HPLC-MS/MS法應(yīng)用需要專用的前處理設(shè)備和成本較高的免疫親和柱，提取凈化步驟較為繁瑣，而且同時(shí)檢測(cè)霉菌毒素的種類仍然比較窄（Shephard 等，2012；鄭翠梅等，2012；趙孔祥等，2011；應(yīng)永飛等，2010）。本研究旨在建立一種飼料及原料樣品經(jīng)簡單的提取、稀釋和加內(nèi)標(biāo)后直接上機(jī)，不需要過多功能凈化柱及脫脂等操作，實(shí)現(xiàn)一次前處理和一針進(jìn)樣,同時(shí)測(cè)定16種霉菌毒素的Qtrap-LC-MS/MS檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 質(zhì)譜型號(hào)為Sciex4500 Qtrap（美國Sciex公司）；液相為島津LC-20AD XR（日本Shimadzu公司）；赫西離心機(jī)（中國湖南赫西儀器裝備有限公司）；HY-3多功能振蕩器（中國江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國 Millipore 公司）；METTLER TOLEDO ME104分析天平[中國梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-Ac-DON）、15-乙?；撗跹└牭毒┐?（15-Ac-DON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（DON-3G）、T-2 毒素（T-2）、HT-2 毒素（HT-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素 A（OTA）、伏馬毒素 B1（FB1）、伏馬毒素 B2（FB2）、雜色曲霉毒素（ST）標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為 0.2~20 μg/mL，Romer公司）；黃曲霉毒素 B1（AFB1）、黃曲霉毒素 B2（AFB2）、黃曲霉毒素 G1（AFG1）、黃曲霉毒素 G2（AFG2）標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為 0.03~1 μg/mL，Sigma-Aldrich 公司）；13C 標(biāo)記的黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙?；撗跹└牭毒┐?、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素（B1、B2）、T-2 毒素、HT-2 毒素、雜色曲霉毒素的14種穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.01~2.5 μg/mL，Romer公司）；甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)，F(xiàn)isher公司）；乙酸銨、甲酸、乙酸（HPLC 級(jí)，美國Sigma 公司）；0.2 μm PTFE 膜針頭過濾器（PALL公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件 Waters公司CORTECSTM UPLC C18柱 （100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）； 柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相A為甲醇，B為含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液，流速：0.3 mL/min。梯度洗脫。

1.2.2 質(zhì)譜條件 加熱電噴霧離子源 （HESI）溫度為500℃；毛細(xì)管電壓為3.2 kV；離子傳輸管溫度為320℃；鞘氣為35 unit，輔助氣為10 unit。fullscan/ddms2掃描模式：采集范圍為200~800Da，正離子采集；一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70000 FWHM，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17500 FWHM；碰撞池能量（NCE）為 35 eV。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別移取一定體積的16種霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到16種霉菌毒素的混標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20℃保存，濃度詳見表1。

表1 霉菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度及相應(yīng)的穩(wěn)定同位素混合溶液

穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液：根據(jù)表1相應(yīng)的穩(wěn)定同位素混合溶液的濃度，分別移取一定體積的14種霉菌毒素穩(wěn)定同位素單標(biāo)溶液于4 mL儲(chǔ)液瓶中，用水稀釋至2 mL配制穩(wěn)定同位素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后于-20℃避光保存。準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用乙腈-水-乙酸溶液（35∶64.5∶0.5）逐級(jí)稀釋，配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。向400 μL內(nèi)插管中加入20 μL 14種穩(wěn)定同位素混合工作液，再分別吸取180 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于內(nèi)插管中，渦旋混勻后準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 樣品前處理方法 稱取飼料樣品（5±0.1）g于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈/水/乙酸（V∶V∶V，70∶29∶1）提取溶劑，渦旋 2 min，振蕩30 min，以4000 r/min離心10 min使固液分離。準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL水稀釋，渦旋混勻1 min，然后以12000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的PTFE濾膜過濾，吸取20 μL預(yù)先渦旋混勻的穩(wěn)定同位素混合溶液于400 μL內(nèi)插管中，再加入180 μL的樣品濾液，混合后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇 本研究選擇的16種霉菌毒素目標(biāo)物涵蓋了我國食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，及歐盟已制定限量法規(guī)的霉菌毒素及其相關(guān)的衍生物。由于霉菌毒素的理化性質(zhì)相差較大，需要選擇合適的提取液和提取程序，否則容易造成毒素的損失。研究表明，霉菌毒素的提取溶劑常采用甲醇、乙腈等（薛毅等，2016；王瑞國等，2015；應(yīng)永飛等，2010）。本研究中鑒于16種毒素的極性，探究了甲醇、乙腈、純水、甲醇水和乙腈水的提取效率，結(jié)果見圖1。由圖1可見，可能與嘔吐毒素的水溶性較好有關(guān)，純水對(duì)12種毒素的提取效率比較低，均低于 55%，DON、DON-3G、3-AcDON、15-AcDON能夠達(dá)到82%以上；純乙腈和甲醇對(duì)12種組分的提取效率為71%~95%，而DON、DON-3G、3-AcDON、15-AcDON 的 提 取 效 率 均 低 于51%，甲醇水對(duì)16種毒素的提取效率均高于88%；而乙腈水對(duì)16種毒素的提取效率均高于90%，效果比甲醇水好。綜上所述，最終選擇乙腈水作為提取溶劑。

2.2 提取方式的選擇 一般在霉菌毒素的檢測(cè)中，前處理相對(duì)比較繁雜，占據(jù)了樣品檢測(cè)周期的大部分時(shí)間，從而使得檢測(cè)效率不高。同時(shí)，在繁雜的前處理凈化過程中，極易造成目標(biāo)物的損失，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的誤差。研究表明。MycoSep 226多功能凈化柱會(huì)吸附FBs、DON糖苷化衍生物和OTA等毒素，導(dǎo)致回收率降低（鄭翠梅等，2012）。然而，近年來隨著質(zhì)譜儀器抗干擾能力及靈敏度的不斷提升，直接提取稀釋法越來越多的被應(yīng)用。圖2為直接提取稀釋法與商品化的多毒素凈化填料（MycoSpin 400）凈化方法對(duì)16種目標(biāo)毒素的回收率，MycoSpin 400前處理方法按照其產(chǎn)品說明書進(jìn)行。結(jié)果顯示，MycoSpin 400對(duì)DON-3G、FB1、FB2及OTA 4種霉菌毒素的回收率不高，主要原因是填料對(duì)這4種毒素有一定的吸附性而導(dǎo)致?lián)p失，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而直接提取稀釋法則可以有效避免該過程中目標(biāo)物的損失，16種毒素的回收率為91%~103%。同時(shí)，毒素的多功能凈化柱選擇性單一，且價(jià)格昂貴。因此，直接提取稀釋法憑借處理過程簡單、快捷和成本低廉而更適合于多種霉菌毒素的快檢前處理。

圖1 不同的提取液對(duì)于目標(biāo)毒素回收率（n=3）結(jié)果

2.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 對(duì)比含不同比例鹽和酸的弱洗脫流動(dòng)相對(duì)16種霉菌毒素質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果見表2，以水為流動(dòng)相時(shí)，大部分的離子響應(yīng)不高，加鹽后大多數(shù)毒素的響應(yīng)明顯提高，其中乙酸銨的增強(qiáng)效果比甲酸銨明顯，同時(shí)低濃度（1 mmol/L）鹽比高濃度（2 mmol/L 及 5 mmol/L）鹽的響應(yīng)信號(hào)更強(qiáng)。而FB1和FB2需要在0.1%甲酸存在時(shí)才有明顯的質(zhì)譜響應(yīng)，因此，最終選擇含有0.1%甲酸的1 mmol/L NH4Ac的水相作為弱洗脫流動(dòng)相，洗脫程序見表3。

2.3.2 離子源溫度的優(yōu)化 圖3為離子源溫度

圖2 直接提取稀釋方法與商品化的多毒素凈化方法（MycoSpin 400）對(duì)于目標(biāo)毒素回收率（n=3）結(jié)果

表2 不同流動(dòng)相對(duì)16種霉菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)的洗脫效果影響

表3 流動(dòng)相梯度洗脫條件

450~550°C全掃描采集到的16種霉菌毒素混標(biāo)的TIC圖。由圖3可知，16組分的信號(hào)隨著源溫度升高其響應(yīng)值會(huì)升高，直至500℃時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大。繼續(xù)升溫至550℃時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度沒有太大的變化，甚至部分毒素（DON、DON-3G等）的信號(hào)強(qiáng)度下降了。此外，一些難裂解的或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物在太高的離子源溫度條件下會(huì)失去一些高質(zhì)量的碎片離子。同時(shí)，高離子源溫度還可能使柱流失增強(qiáng)而導(dǎo)致基線增高。因此，綜合考慮16種毒素的高質(zhì)量離子信號(hào)強(qiáng)度，低的干擾離子信號(hào)及理想的峰形等因素，最佳的離子源溫度為500℃。

圖3 離子源溫度450～550°C全掃描采集到的16種霉菌毒素混標(biāo)的TIC圖

2.3.3 掃描模式的選擇 質(zhì)譜儀的一般掃描模式有全掃描（Full Scan）、選擇離子掃描（SIM）、子離子掃描 （Product Scan）、 母離子掃描（Precursor Scan）、中性碎片丟失掃描（Neutral Loss）和多反應(yīng)掃描（MRM）等模式。本文探究了以上幾種掃描模式條件下的16種毒素的掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)只有在MRM模式下，得到的總離子圖中，16種毒素信號(hào)強(qiáng)度高、不會(huì)丟失部分信號(hào)及離子峰形勻稱飽滿。同時(shí)，比較了普通的MRM掃描模式和增強(qiáng)分段MRM掃描模式的效果，發(fā)現(xiàn)后者的噪音干擾更低，靈敏度較高。因此采用分段MRM掃描模式。

2.3.4 駐留時(shí)間的優(yōu)化 在質(zhì)譜的掃描過程中，駐留時(shí)間的長短會(huì)影響信號(hào)的點(diǎn)數(shù)，從而關(guān)系到所得到碎片離子的信息完整性，離子峰形對(duì)稱及基線噪聲干擾的大小。對(duì)于多組分同時(shí)測(cè)定時(shí)，如果駐留時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致質(zhì)譜采集點(diǎn)數(shù)不夠，質(zhì)譜信息量降低，造成部分碎片離子信號(hào)的丟失，重現(xiàn)性降低，且得到的色譜峰峰形較差。如果駐留時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)干擾信號(hào)比較大，靈敏度降低，從而不能對(duì)樣品中痕量目標(biāo)物的精確定量。因此，采取合適的駐留時(shí)間至關(guān)重要。本文探究了16種毒素分別在駐留時(shí)間為200、100 ms和50 ms的情況，由圖4可知，16種毒素在100 ms時(shí)的離子信息完全，噪音干擾低，靈敏度較高。因此，最佳的駐留時(shí)間為100 ms。

圖4 駐留時(shí)間為200、100 ms和50 ms全掃描采集到的16種霉菌毒素混標(biāo)的TIC圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣 按照上述優(yōu)化的各項(xiàng)條件，對(duì)16種霉菌毒素的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)分析，以穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量，相關(guān)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，16種毒素標(biāo)準(zhǔn)品能夠有效分離，得到精確保留時(shí)間。同時(shí)，得到了所有的選擇離子精確質(zhì)量，質(zhì)量數(shù)與理論計(jì)算值非常接近。因此，16種毒素的HPLC/MS/MS方法條件優(yōu)化完成，可以滿足實(shí)際應(yīng)用于樣品的日常檢測(cè)。

表4 相關(guān)毒素的保留時(shí)間和選擇離子的精確分子質(zhì)量

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了飼料中常見16種霉菌毒素的提取、凈化及高效液相色譜-三重四級(jí)桿/離子阱質(zhì)譜分析條件。得到了16種霉菌毒素的精確保留時(shí)間和選擇離子的精確質(zhì)量數(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了16種霉菌毒素的同時(shí)快速定性和定量分析。該方法前處理簡單、快速、準(zhǔn)確度高，可滿足飼料中常見霉菌毒素的殘留檢測(cè)分析要求。

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The residue extraction，purification and liquid chromatography-triple level 4 bar/linear ion trap tandem mass spectrometry（Qtrap-LC-MS/MS） detection method of 16 kinds of mycotoxins in feed were optimized and established in this paper.Mycotoxins were extracted by 20 mL of acetonitrile/water/acetic acid （V∶V∶V，70∶29∶1） solution，diluted and detected.The gradient elution procedure was used with 0.1%formic acid and 1 mmol/L NH4Ac as weak elution mobile phase.The ion source temperature was 500 ℃ and dwell time was 100 ms，using segmented MRM scan mode.Mycotoxins were well separated with smooth baseline，high select ion signal intensity and the weak signal interference.All select ion mass numbers of mycotoxins were also obtained，which was very close to the theoretical calculation value.The optimization conditions for Qtrap-LC-MS/MS method of mycotoxins were found.It realized both qualitative and quantitative analysis of 16 kinds of mycotoxins in feed.

mycotoxin；qtrap-LC-MS/MS；isotope internal standard；optimization

S816.17

A

1004-3314（2017）21-0025-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172106

江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20161BBF60115）

*通訊作者