楊 信， 李布勇， 范小平， 李慶霞， 楊綺紋

（海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，海南海口 570203）

飼料中隱蔽嘔吐毒素研究進(jìn)展

楊 信， 李布勇*， 范小平， 李慶霞， 楊綺紋

（海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，海南?？?570203）

嘔吐毒素是鐮刀菌屬毒素中的一種，在飼料原料中通常會(huì)被衍生為乙?；吞腔螒B(tài)，統(tǒng)稱為隱蔽嘔吐毒素。本文主要對(duì)飼料中隱蔽嘔吐毒素的形成機(jī)制、檢測(cè)方法、污染分布情況、毒性機(jī)理、以及體外和體內(nèi)的毒性進(jìn)行了綜述。

隱蔽嘔吐毒素；檢測(cè)方法；污染分布；體外毒性；體內(nèi)毒性

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又稱嘔吐毒素（DON），是一種主要由鐮刀菌屬產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，屬于B類單端孢霉烯毒素，其對(duì)谷物的污染程度位于鐮刀菌毒素之首，對(duì)動(dòng)物健康威脅巨大，尤其對(duì)豬的危害最大，其中毒癥包括拒食、嘔吐、免疫抑制和繁殖障礙等（陳繼發(fā)，2016）。DON多分布于玉米、小麥、大麥等谷物中，在玉米加工副產(chǎn)物DDGS、玉米蛋白飼料中含量呈累積增加的趨勢(shì)。目前我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告中對(duì)飼料中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1000 μg/kg，但是對(duì)飼料原料玉米、小麥及副產(chǎn)物中尚沒(méi)有限量標(biāo)準(zhǔn)。

飼料中嘔吐毒素通常和其衍生化形態(tài)共同存在，也被稱為隱蔽嘔吐毒素。衍生化形態(tài)包括乙?；问?-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3ADON），15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15ADON）和糖基化形式脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON3G），不同修飾形態(tài)的嘔吐毒素具有相同的基本分子式，但是其特征功能團(tuán)不同（He，2010）。

近年來(lái)大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼料中隱蔽嘔吐毒素對(duì)動(dòng)物的毒性不容忽視。本文就隱蔽嘔吐毒素的形成機(jī)制、檢測(cè)方法、污染分布情況、毒性機(jī)理，以及體外和體內(nèi)的毒性研究進(jìn)行了綜述。

1 隱蔽嘔吐毒素形成機(jī)制

植物被無(wú)法降解的霉菌毒素感染后，會(huì)啟動(dòng)自身防御機(jī)制來(lái)降低霉菌毒素對(duì)其的傷害，機(jī)制分為三個(gè)階段：第一階段激活，毒素被水解和氧化，將親脂性的部分轉(zhuǎn)為親水性，為第二階段做準(zhǔn)備；第二階段修飾，毒素被內(nèi)源性的谷胱甘肽、糖、氨基酸、硫酸鹽、乙?；揎棧M(jìn)一步加強(qiáng)極性和親水性；第三階段隔離，被修飾的霉菌毒素經(jīng)過(guò)ATP-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移作用轉(zhuǎn)移到液泡、非原質(zhì)體（細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙）中來(lái)降低霉菌毒素對(duì)植物的傷害（Coleman，1997）。嘔吐毒素由于其親水性，其在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化直接從第二階段開始，主要形成乙?；?ADON、15ADON和葡糖苷化的DON3G。經(jīng)過(guò)修飾的嘔吐毒素會(huì)一直存在于植物原料內(nèi)，并會(huì)隨著食用、消化和吸收而產(chǎn)生毒性來(lái)?yè)p害家畜。

2 隱蔽嘔吐毒素的檢測(cè)方法

目前對(duì)隱蔽嘔吐毒素的檢測(cè)方法主要是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（表1），提取液一般為乙腈/水（84/16），Zbynek和 Dzumand 等（2014）用 0.1%甲酸水/乙腈（50∶50）提取液也達(dá)到了很好的提取效果；提取方式一般采用超聲或振蕩處理，但時(shí)間一般不低于30 min。3ADON、15ADON和DON3G在基質(zhì)玉米、小麥、配合飼料中均呈基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此需選擇合適的凈化體系降低雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性的影響，國(guó)內(nèi)凈化主要采取SPE萃取小柱（Mycospin 400多功能凈化柱），國(guó)外采取直接提取不凈化或采用QuEChERS凈化體系，包括采用硫酸鎂、正己烷、C18吸附的凈化劑，但是各種凈化體系并不能很好的減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)量的影響，因此建議采取不同基質(zhì)匹配校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)定量，從而獲得更好的回收率。Zbynek（2014）證明，C18吸附劑雖然不能消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，但是能明顯吸附飼料中的脂內(nèi)物質(zhì)來(lái)降低對(duì)色譜柱的影響，因此在檢測(cè)中建議加入凈化步驟而不是直接提取稀釋后上機(jī)檢測(cè)。

表1 隱蔽嘔吐毒素的不同檢測(cè)方法

3 隱蔽嘔吐毒素在飼料原料和飼料成品中的污染情況

隨著液質(zhì)技術(shù)的發(fā)展，目前關(guān)于隱蔽嘔吐毒素在飼料原料和飼料成品中的污染狀況研究報(bào)道較多（表2）。研究表明ADON+15ADON在681份小麥樣品中檢出最大值為14604.2 μg/kg，平均值為 7983.5 μg/kg， 檢出率為63.2%，DON3G在 30份小麥中檢出最大值為730 μg/kg，平均值為174 μg/kg，檢出率為 83.3%，Zachariasova等（2014）在豬配合飼料中對(duì)3ADON、15ADON和DON3G均有不同程度的檢出，隨著對(duì)隱蔽嘔吐毒素在飼料原料、成品污染的現(xiàn)狀和其毒性的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，建議對(duì)我國(guó)飼料原料和成品中隱蔽嘔吐毒素的污染情況和其合理的限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

表2 飼料原料和成品中隱蔽嘔吐毒素的含量

4 嘔吐毒素的毒性機(jī)理

目前乙?；吞腔瘒I吐毒素的關(guān)注點(diǎn)主要在于是否被體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)化為原型產(chǎn)生毒性，以及本身是否有毒性。因此關(guān)注嘔吐毒素原型毒性的主要產(chǎn)生機(jī)理，有利于對(duì)隱蔽嘔吐毒素的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4.1 嘔吐毒素的核糖體應(yīng)激反應(yīng) 研究證明，DON能同核糖體的60S亞基結(jié)合。DON的3-羥基基團(tuán)能同核糖體60S亞基A-面上的鎂原子和核苷酸結(jié)合（Pierron，2016），同時(shí) Pierron（2016）還發(fā)現(xiàn)，DON的第3位、12位、15位分別能同核糖體上肽基轉(zhuǎn)移酶中心上的核糖體形成氫鍵。DON與核糖體結(jié)合后，首先激活蛋白激酶（PKR）、斯裂原活化蛋白激酶（MAPKs），進(jìn)而激活雙鏈上游關(guān)鍵傳感器（RNAPKR）。激活PKR后會(huì)觸發(fā)以下機(jī)制：（1）通過(guò)激活腫瘤抑制基因（P53)、氨基末端激酶（JNK）、P38 蛋白、核因子 kB （NF-kB)而對(duì)細(xì)胞分化和凋亡產(chǎn)生影響；（2）使真核啟動(dòng)子2α磷酸化而抑制蛋白翻譯，從而影響蛋白質(zhì)的合成來(lái)產(chǎn)生介毒性；（3）通過(guò)激活信號(hào)傳導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄激活子、干擾素調(diào)節(jié)因子來(lái)影響基因表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、變異、凋亡而引起機(jī)體各種生理反應(yīng)。

4.2 氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和DNA損傷反應(yīng)嘔吐毒素能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和 DNA 損傷（Mishara，2014）。 Krishnaswamy等（2010)報(bào)道，人結(jié)腸細(xì)胞經(jīng)DON感染24h后，活性氧含量大量增加，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、抗氧化酶、過(guò)氧化物歧化酶的活性降低，同時(shí)誘發(fā)環(huán)氧酶的表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的磷酸化而引起細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

5 乙?；瘒I吐毒素的毒性

5.1 乙酰化嘔吐毒素（3ADON、15ADON）的體外毒性 目前體外研究報(bào)道均證實(shí)，乙?；瘒I吐毒素能同嘔吐毒素一樣直接產(chǎn)生毒性作用，毒性從強(qiáng)到弱依次為DON≈15ADON＞3ADON。Nathn Broekaert等（2016）證實(shí)，乙?；瘒I吐毒素能影響動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的增殖和發(fā)育，其采用流式細(xì)胞術(shù)研究原型嘔吐毒素和乙?；瘒I吐毒素對(duì)體外小腸上皮細(xì)胞的毒性發(fā)現(xiàn)，其對(duì)小腸上皮細(xì)胞的毒性為：DON≈15ADON＞3ADON。Pinton 等（2014)報(bào)道，同對(duì)照相比，DON、3ADON和15 ADON分別能使豬腸道上皮細(xì)胞（IPEC-1）增殖指數(shù)在24 h內(nèi)降低 60%（P＜ 0.001），13%（P＜ 0.05） 和 69%（P＜0.001）， 其中10 μM的15 ADON能使緊密連接蛋白的表達(dá)降低40%。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DON、3ADON和15ADON均能激活I(lǐng)PEC-1上MAPKS的活性，繼而產(chǎn)生炎性反應(yīng)。

3ADON和15ADON還能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。Alassane-Kpembi（2015)等采用 MTT比色法研究DON、3ADON和15ADON對(duì)人克隆結(jié)腸腺細(xì)胞（Caco-2）生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，DON和15ADON 的 80%抑制濃度（EC80）為 16.5 μmol/L和10.5 μmol/L，3ADON也能抑制Caco-2的活性，但是其毒性要低于DON和15ADON，其EC80為125 μmol/L。 而 Ana Juan-García（2015）發(fā)現(xiàn)，對(duì)于Hep G2細(xì)胞生長(zhǎng)，3ADON毒性要大于15ADON，其采用MTT比色法研究對(duì)Hep G2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 發(fā) 現(xiàn) ，3ADON 的 IC50 為 3.6 ～ 6.2 μmol/L，15ADON的 IC50為5.2～8.1 μmol/L。

5.2 乙?；瘒I吐毒素（3ADON、15ADON）的體內(nèi)毒性 通過(guò)體內(nèi)飼養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3ADON和15ADON分別被肉雞和豬采食后均能被吸收和分解成DON原型而產(chǎn)生毒性，但是肉雞對(duì)3ADON和15ADON的耐受性要大于豬。Nathan Broekaert等（2015）報(bào)道，DON、3ADON 和 15ADON 被肉雞采食后，吸收率分別為10.6%、18.2%和42.2%。3ADON被吸收后全部分解為 DON，75.4%的15ADON被吸收后分解為DON，故3ADON和15ADON在被家禽吸收后會(huì)分別轉(zhuǎn)化為18.2%和31.9%的DON而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。同時(shí)由于15ADON會(huì)產(chǎn)生更多的DON原型被吸收，故對(duì)于肉雞，15ADON的毒性被認(rèn)為還要大于DON。對(duì)于豬，DON、3ADON和15ADON被采食后完全被吸收，而且完全分解為DON產(chǎn)生毒性，故對(duì)于豬，3ADON和15ADON的體內(nèi)毒性不容忽視。

6 糖基化嘔吐毒素的毒性

6.1 糖基化嘔吐毒素（D3G）的體外毒性 由于D3G中的葡萄糖苷基團(tuán)形成的空間位置阻礙，D3G不能像DON一樣同核糖體60S亞基A-面上的肽基轉(zhuǎn)移酶中心結(jié)合，而直接產(chǎn)生毒性。體外試驗(yàn)證明，DON3G的直接毒性要遠(yuǎn)低于DON，Alix Pierron等（2015）對(duì)人小腸Caco-2細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D3G不能激活JNK和蛋白激酶（MAPK）而產(chǎn)生毒性。 Pierron等（2015）研究 DON和DON3G對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，48 h后，DON 的半抑制濃度（IC50）為 1.3 μmol/L，與此對(duì)比，10 μmol/L的 DON3G對(duì) Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)不產(chǎn)生任何毒性。

6.2 糖基化嘔吐毒素（D3G）的體內(nèi)毒性 體外試驗(yàn)證明D3G基本不產(chǎn)生毒性，對(duì)其毒性的評(píng)價(jià)主要集中在D3G被采食后是否能轉(zhuǎn)化為DON原型而對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性。試驗(yàn)證明D3G被采食后可形成DON原型。

Veronika（2014)等分別在第 1、5 天和 9 天對(duì)斷奶仔豬強(qiáng)飼對(duì)照日糧、D3G （116 μg/kg·BW）和DON（75 μg/kg·BW）的日糧，并在飼喂后 24 h 對(duì)尿液和糞便全收集，分析尿液和糞便中的DON、D3G和其他代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞便中基本回收不到DON及代謝產(chǎn)物，回收集中在尿液中，其中單獨(dú)飼喂含DON日糧斷奶仔豬尿中總回收84.9%，分別為51.4%DON，19.0%DON-3-GlcA和14.5%DON-15-GlcA，單獨(dú)飼喂含D3G日糧，尿液中出現(xiàn)了DON原型，總回收為40.3%，其中含 21.6%DON，3.4%DON-3-GlcA，6.8%DON-15-GlcA，5.9%DOM-1，2.6%D3G。 表明采食 D3G 的生物活性要低于DON，從回收看只占DON的一半左右。但是D3G在被吸收后可釋放出糖苷配基產(chǎn)生原型DON，并被吸收和參與體內(nèi)代謝而產(chǎn)生毒性。同時(shí)單獨(dú)飼喂含D3G豬尿液中的產(chǎn)物出現(xiàn)了單獨(dú)飼喂DON中并沒(méi)有產(chǎn)生的DOM-1，在豬的消化吸收途徑中，DOM-1主要是通過(guò)豬尾腸的微生物分解DON而產(chǎn)生，因此可以推測(cè)單獨(dú)飼喂DON時(shí)，DON基本都是在近端被小腸吸收，進(jìn)而代謝，而D3G則部分進(jìn)入尾腸，被分解為DON原型產(chǎn)生毒性，在尾腸中DON代謝途徑包括修飾為DON-3-GlcA和DON-15-GlcA，也可以分解為DOM-1被解毒。

Nathan Broekaert等（2017）通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定血漿中的DON和其代謝物，D3G被肉雞采食后并不能降解為DON原型，但是DON被采食后，在血漿中可檢測(cè)到DON的硫酸鹽化產(chǎn)物DONS，D3G被豬采食后，血液中可檢測(cè)到DON原型和DON-GlcA產(chǎn)物，但是D3G被采食后的吸收程度（16.1±5.4）%要低于 DON（81.3±17.4）%。 因此，DON在豬體內(nèi)的第二階段修飾主要為葡糖苷酸化（Veronika等，2014），在雞體內(nèi)則主要是硫酸鹽化，同時(shí)DON代謝中第二階段的修飾作用在雞體內(nèi)更為廣泛，這也可能是雞比豬耐受DON毒性能力強(qiáng)的原因。

7 小結(jié)

綜上所述，隱蔽嘔吐毒素在飼料中的污染情況不容忽視，應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)其含量時(shí)一定要考慮基質(zhì)效應(yīng)，定量需要使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。隱蔽嘔吐毒素的體外毒性從強(qiáng)到弱依次為 DON≈15ADON＞3ADON＞＞D3G， 同時(shí)飼養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙?；?5ADON、3ADON和D3G均能在豬體內(nèi)轉(zhuǎn)化為DON原型而產(chǎn)生毒性。目前對(duì)于隱蔽嘔吐毒素的研究尚不多見，仍有一些問(wèn)題有待進(jìn)一步解決，例如：隱蔽嘔吐毒素在動(dòng)物體內(nèi)的消化、吸收和代謝過(guò)程還需要進(jìn)一步研究，同時(shí)研究飼料中不同濃度隱蔽嘔吐毒素對(duì)動(dòng)物的毒性作用和生產(chǎn)性能的影響，從而為制定隱蔽嘔吐毒素在飼料中的科學(xué)限量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

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The deoxynivalenol （DON）is one of the toxins of fusarium，and often derived as acetylated and glucoside forms in feedstuff，which are collectively called hidden deoxynivalenol.In this paper，the formation mechanism，determination，distribution，toxicodynamics，cytotoxicity in vitro and vivo of hidden deoxynivalenol in feed were reviewed.

hidden deoxynivalenol；determination；distribution；cytotoxicity in vitro；cytotoxicity in vitro

S816.9

A

1004-3314（2017）21-0007-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172102

海南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全體系建設(shè)項(xiàng)目（UQ74051）

*通訊作者