◎秦靜怡 陳丹娜 徐倩

牛血清小分子肽的分離

◎秦靜怡 陳丹娜 徐倩

目的：從牛血清中分離出小分子肽。方法：將胎牛血清串聯(lián)超濾得到分子質(zhì)量1k-3kDa的組分；將超濾濃縮組分作葡聚糖凝膠G-25層析，收集對應(yīng)吸收峰的洗脫液；C18RP-HPLC脫鹽純化洗脫液樣品后質(zhì)譜儀檢測。結(jié)果：血清1k-3kDa的超濾濃縮組分洗脫液有2個吸收峰，收集到吸收峰1對應(yīng)的洗脫液，經(jīng)C18RP-HPLC純化后質(zhì)譜儀檢測，結(jié)果顯示內(nèi)有純度較高的分子質(zhì)量為1794Da的肽。結(jié)論：牛血清分子質(zhì)量1k-3kDa組分內(nèi)含有含量較高的小分子肽。

血清中含有大量來源廣泛的小分子肽，其中大部分與載體蛋白結(jié)合，這就造成小分子肽的分離純化較難進(jìn)行。近年研究表明，血清中小分子肽很多都具有生理作用或藥理作用。筆者發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量5kDa以下的肽相關(guān)研究較少，故本研究試圖從牛血清中分離小分子肽，以期能確定一種或幾種小分子肽結(jié)構(gòu)和名稱，鑒定其生物活性，并探討其作用機(jī)制。

材料與方法

材料與試劑

胎牛血清(四季青公司)，葡聚糖凝膠G-25型(安瑪西亞公司)，三羥甲基氨基甲烷（Sigma公司），分析純冰醋酸（上海生工）

儀器與設(shè)備

MILLIPORE 8400超 濾 杯（MILLIPORE公司 ），RMM3000超濾膜（MILLIPORE公司），79-1型磁力攪拌器（中國江蘇金壇市望華科教儀器廠），SC100A Speedvac Plus真空冷凍干燥機(jī)（Thermo Savant公司），超低溫冰箱 （美國Forma Scientific），721型分光光度計(jì)（中國上海）

方法

串聯(lián)超濾。超濾杯消毒后正常安裝，預(yù)處理濾膜，無菌條件下將200ml胎牛血

清倒入杯內(nèi)，在2.5MPa的N2氣氣壓下，用截留分子質(zhì)量MWCO為3kDa的超

濾膜與截留分子質(zhì)量MWCO為1kDa的超濾膜在低溫下進(jìn)行串聯(lián)超濾，收集分

子質(zhì)量1k-3k Da的超濾濃縮組分5～10ml，除菌過濾，低溫保存。

葡聚糖凝膠 G-25層析。預(yù)處理凝膠，裝柱，凝膠表面預(yù)留約3cm左右的洗脫液。調(diào)節(jié)層析柱下端出口，使得洗脫液洗流速約為1ml/min，分別檢測出胸腺肽α（分子質(zhì)量3108Da）和催產(chǎn)素（分子質(zhì)量1007Da）在215nm下的吸收峰出現(xiàn)時間。以胸腺肽α和催產(chǎn)素吸收峰出現(xiàn)時間為參照，確定血清1k-3kDa的超濾濃縮組分吸收峰出現(xiàn)時間，收集吸收峰的洗脫液，真空冷凍干燥。

C18RP-HPLC脫鹽純化及質(zhì)譜分析。將凍干樣品用蒸餾水溶解，調(diào)整乙腈洗脫濃度梯度，進(jìn)行RP-HPLC，收集洗脫峰，并用通過質(zhì)譜儀鑒定洗脫峰中物質(zhì)。

圖1 C18RP-HPLC吸收峰成分的質(zhì)譜分析

結(jié)果與討論

結(jié)果

葡聚糖凝膠 G-25層析。以胸腺肽α和催產(chǎn)素吸收峰出現(xiàn)時間為參照，血清1k-3kDa的超濾濃縮組分在37min開始出現(xiàn)第一個吸收峰，75min出現(xiàn)第二個吸收峰，實(shí)驗(yàn)中主要收集第一個吸收峰對應(yīng)的洗脫液。

C18RP-HPLC質(zhì)譜分析。將洗脫峰樣品進(jìn)行RP-HPLC，收集到吸光度最高的洗脫峰，并用通過質(zhì)譜儀鑒定洗脫峰中物質(zhì)。圖2-1為脫峰中質(zhì)譜圖譜，顯示其中含有分子量純度較高分子量為1794Da的小分子肽。

討論

血清小分子肽可以在很多生理過程中產(chǎn)生，又因?yàn)檩^易被吸收，常參與多種生理活動調(diào)節(jié)。本研究選擇細(xì)胞培養(yǎng)常用的胎牛血清進(jìn)行研究，因?yàn)樵谠?xì)胞培養(yǎng)中，不加細(xì)胞生長因子原代細(xì)胞會趨向一種類型細(xì)胞分化，這一現(xiàn)象可能意味著血清中一些小分子物質(zhì)對細(xì)胞生長分化有影響。

實(shí)驗(yàn)葡聚糖凝膠 G-25層析結(jié)果顯示，血清1k-3kDa的超濾濃縮組分內(nèi)含有一些濃度較高的小分子肽。

C18RP-HPLC脫鹽及分離收集單一洗脫峰，將洗脫峰收集起來質(zhì)譜儀檢測，發(fā)現(xiàn)里面含有一種純度較高的小分子肽，分子量為1794Da，說明在血清血清1000-3000Da的超濾濃縮組分中間，這種肽類含量較高，且通過數(shù)據(jù)庫查詢，搜索不到相應(yīng)的信息，極有可能是新發(fā)現(xiàn)的肽。

湖南省教育廳課題，課題編號（12C0511）;湖南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目，項(xiàng)目編號（12C0513）

（作者單位：長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）