◎秦靜怡 陳丹娜 徐倩
牛血清小分子肽的分離
◎秦靜怡 陳丹娜 徐倩
目的:從牛血清中分離出小分子肽。方法:將胎牛血清串聯(lián)超濾得到分子質(zhì)量1k-3kDa的組分;將超濾濃縮組分作葡聚糖凝膠G-25層析,收集對應(yīng)吸收峰的洗脫液;C18RP-HPLC脫鹽純化洗脫液樣品后質(zhì)譜儀檢測。結(jié)果:血清1k-3kDa的超濾濃縮組分洗脫液有2個吸收峰,收集到吸收峰1對應(yīng)的洗脫液,經(jīng)C18RP-HPLC純化后質(zhì)譜儀檢測,結(jié)果顯示內(nèi)有純度較高的分子質(zhì)量為1794Da的肽。結(jié)論:牛血清分子質(zhì)量1k-3kDa組分內(nèi)含有含量較高的小分子肽。
血清中含有大量來源廣泛的小分子肽,其中大部分與載體蛋白結(jié)合,這就造成小分子肽的分離純化較難進(jìn)行。近年研究表明,血清中小分子肽很多都具有生理作用或藥理作用。筆者發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量5kDa以下的肽相關(guān)研究較少,故本研究試圖從牛血清中分離小分子肽,以期能確定一種或幾種小分子肽結(jié)構(gòu)和名稱,鑒定其生物活性,并探討其作用機(jī)制。
材料與試劑
胎牛血清(四季青公司),葡聚糖凝膠G-25型(安瑪西亞公司),三羥甲基氨基甲烷(Sigma公司),分析純冰醋酸(上海生工)
儀器與設(shè)備
MILLIPORE 8400超 濾 杯(MILLIPORE公司 ),RMM3000超濾膜(MILLIPORE公司),79-1型磁力攪拌器(中國江蘇金壇市望華科教儀器廠),SC100A Speedvac Plus真空冷凍干燥機(jī)(Thermo Savant公司),超低溫冰箱 (美國Forma Scientific),721型分光光度計(jì)(中國上海)
方法
串聯(lián)超濾。超濾杯消毒后正常安裝,預(yù)處理濾膜,無菌條件下將200ml胎牛血
清倒入杯內(nèi),在2.5MPa的N2氣氣壓下,用截留分子質(zhì)量MWCO為3kDa的超
濾膜與截留分子質(zhì)量MWCO為1kDa的超濾膜在低溫下進(jìn)行串聯(lián)超濾,收集分
子質(zhì)量1k-3k Da的超濾濃縮組分5~10ml,除菌過濾,低溫保存。
葡聚糖凝膠 G-25層析。預(yù)處理凝膠,裝柱,凝膠表面預(yù)留約3cm左右的洗脫液。調(diào)節(jié)層析柱下端出口,使得洗脫液洗流速約為1ml/min,分別檢測出胸腺肽α(分子質(zhì)量3108Da)和催產(chǎn)素(分子質(zhì)量1007Da)在215nm下的吸收峰出現(xiàn)時間。以胸腺肽α和催產(chǎn)素吸收峰出現(xiàn)時間為參照,確定血清1k-3kDa的超濾濃縮組分吸收峰出現(xiàn)時間,收集吸收峰的洗脫液,真空冷凍干燥。
C18RP-HPLC脫鹽純化及質(zhì)譜分析。將凍干樣品用蒸餾水溶解,調(diào)整乙腈洗脫濃度梯度,進(jìn)行RP-HPLC,收集洗脫峰,并用通過質(zhì)譜儀鑒定洗脫峰中物質(zhì)。
圖1 C18RP-HPLC吸收峰成分的質(zhì)譜分析
結(jié)果
葡聚糖凝膠 G-25層析。以胸腺肽α和催產(chǎn)素吸收峰出現(xiàn)時間為參照,血清1k-3kDa的超濾濃縮組分在37min開始出現(xiàn)第一個吸收峰,75min出現(xiàn)第二個吸收峰,實(shí)驗(yàn)中主要收集第一個吸收峰對應(yīng)的洗脫液。
C18RP-HPLC質(zhì)譜分析。將洗脫峰樣品進(jìn)行RP-HPLC,收集到吸光度最高的洗脫峰,并用通過質(zhì)譜儀鑒定洗脫峰中物質(zhì)。圖2-1為脫峰中質(zhì)譜圖譜,顯示其中含有分子量純度較高分子量為1794Da的小分子肽。
討論
血清小分子肽可以在很多生理過程中產(chǎn)生,又因?yàn)檩^易被吸收,常參與多種生理活動調(diào)節(jié)。本研究選擇細(xì)胞培養(yǎng)常用的胎牛血清進(jìn)行研究,因?yàn)樵谠?xì)胞培養(yǎng)中,不加細(xì)胞生長因子原代細(xì)胞會趨向一種類型細(xì)胞分化,這一現(xiàn)象可能意味著血清中一些小分子物質(zhì)對細(xì)胞生長分化有影響。
實(shí)驗(yàn)葡聚糖凝膠 G-25層析結(jié)果顯示,血清1k-3kDa的超濾濃縮組分內(nèi)含有一些濃度較高的小分子肽。
C18RP-HPLC脫鹽及分離收集單一洗脫峰,將洗脫峰收集起來質(zhì)譜儀檢測,發(fā)現(xiàn)里面含有一種純度較高的小分子肽,分子量為1794Da,說明在血清血清1000-3000Da的超濾濃縮組分中間,這種肽類含量較高,且通過數(shù)據(jù)庫查詢,搜索不到相應(yīng)的信息,極有可能是新發(fā)現(xiàn)的肽。
湖南省教育廳課題,課題編號(12C0511);湖南省高等學(xué)??茖W(xué)研究項(xiàng)目,項(xiàng)目編號(12C0513)
(作者單位:長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)