劉歡，孟穎穎，牛麗芳，林浩

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基因編輯技術研究進展及其在苜蓿等豆科飼草作物中的應用

劉歡，孟穎穎，牛麗芳，林浩

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081

基因編輯是對生物基因組進行靶向修飾的一項新型生物技術，可以在不同物種中實現(xiàn)對目標基因的定點敲除、基因片段置換以及基因定點插入等基因定向編輯，目前基因編輯技術已在植物基因功能解析和作物遺傳改良研究中得到廣泛應用。本文簡要回顧基因編輯技術的發(fā)展歷程，重點介紹新近發(fā)展的CRISPR/Cas9技術在植物中的研究進展，并對CRISPR/Cas基因編輯技術在苜蓿等飼草作物中的應用進行探討和展望。

基因編輯，CRISPR/Cas9，豆科飼草作物，苜蓿

近年來，基因編輯技術的快速發(fā)展為生物學研究開辟了新的研究領域。基因編輯技術是基于序列特異核酸酶在基因組水平上對靶標基因進行定向、準確修飾的一種新興的基因工程方法[1-3]。序列特異性核酸酶通過識別和錨定基因組上的靶標位點序列，對目標DNA進行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)，引起生物體內(nèi)發(fā)生同源重組(Homologous recombination，HR) 或非同源末端連接(Non homologous end joining，NHEJ) 進行修復，造成基因組特定位點出現(xiàn)堿基缺失或插入進而實現(xiàn)對基因組的定向修飾[4-5]。目前，已成功發(fā)展的基因編輯技術主要包括鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases，ZFNs) 技術[6-7]、類轉錄激活子效應蛋白核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 技術[8-9]、巨核酶(Meganucleases，MGNs) 技術[10]以及新近發(fā)展的CRISPR/Cas系統(tǒng)(The clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated)[11-14]。其中CRISPR/Cas基因編輯技術由于具有操作簡單、編輯高效、成本低廉等優(yōu)點，目前已廣泛應用于擬南芥、煙草、西紅柿、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米等植物和主要農(nóng)作物的基因功能研究和重要農(nóng)藝性狀遺傳改良[15-23]。

優(yōu)化調整種植業(yè)結構，支持飼料作物種植，促進糧食作物、經(jīng)濟作物、飼料作物三元種植結構協(xié)調發(fā)展是我國新形勢下應對居民膳食結構改變、緩解糧食供求矛盾的重要舉措。享有“牧草之王”美譽的紫花苜蓿是世界上應用最廣、經(jīng)濟價值最高和栽培面積最大的一種優(yōu)質豆科飼料作物。苜蓿的產(chǎn)量和品質改良是我國當前飼料業(yè)、畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的重大迫切需求。與水稻、小麥、玉米、大豆等主要糧食作物和經(jīng)濟作物相比，目前苜蓿等飼草作物功能基因組學研究尚處于起步階段，相應的基因功能研究和分子遺傳改良的研究工具和技術手段有限，極大地限制了飼草作物分子育種技術的應用與發(fā)展。本文簡要回顧ZFN、TALEN、MGN以及CRISPR/Cas9等基因編輯技術的發(fā)展歷程，重點介紹新近發(fā)展的CRISPR/Cas9技術在植物中的研究進展，并對該基因編輯技術在苜蓿等飼草作物中的應用進行探討和展望，希望為苜蓿等豆科飼草作物的功能基因組學研究及遺傳改良提供新的研究思路。

1 基因編輯技術的發(fā)展歷程

1.1 ZFN基因編輯技術

ZFN是一種人工改造的核酸酶，由負責特異性識別靶標序列的鋅指蛋白DNA結合域(Zinc finger DNA-binding domain) 和TypeⅡS類限制酶Ⅰ[24]C端的非特異性DNA切割結構域兩部分組合而成[25]。通過定向改造ZFN鋅指DNA結合域的序列識別特異性，可以實現(xiàn)ZFN特異性地結合生物基因組中的靶標基因序列，并利用Ⅰ的DNA切割結構域進行剪切，達到基因編輯的目的[6,26]。1996年，Kim等首先報道了將鋅指蛋白連接到Ⅰ的DNA切割結構域可以產(chǎn)生1個新型的有活性的位點識別特異性核酸酶，并且該人工改造的新型鋅指核酸酶可以特異性地切割DNA序列[25]，標志著ZFN基因編輯技術的出現(xiàn)。

目前最常用的ZF (Zinc finger) 結構為Cys2-His2鋅指，大約由30個氨基酸包裹1個鋅原子構成，每個鋅指蛋白結構域能夠特異性地識別和結合3個核酸堿基[27]。研究表明，通過增加鋅指蛋白的數(shù)量可以擴大ZFN識別靶標DNA序列的長度，進而提高其序列識別特異性[28]。Ⅰ是一種TypeⅡS限制核酸酶，由于Ⅰ僅在二聚體狀態(tài)下才具備核酸酶活性，因此通常針對1個靶位點需要設計一對ZFNs，并且二者結合序列的間隔區(qū)域保持在6?8 bp以確保Ⅰ二聚體的形成[29]。ZFN利用鋅指結構域特異性地結合目標DNA序列，并通過Ⅰ的DNA切割結構域對靶位點進行切割，導致目標DNA雙鏈斷裂，進而利用細胞內(nèi)的同源重組或非同源末端連接等修復機制實現(xiàn)目標基因的靶向敲除[6,30-31]。目前ZFN技術已成功應用于擬南芥、煙草、玉米和大豆等植物基因編輯[2,32]。

1.2 TALEN基因編輯技術

TALEN技術是第二代人工改造核酸酶技術，TALEN的構成與ZFN相似，由TAL效應因子(Transcription activator-like effector) 的DNA結合域與核酸酶Ⅰ的DNA切割結構域兩部分組成[33]。TAL效應因子是黃單胞屬植物病原菌分泌的一種細菌侵染植物的效應蛋白，第一個TAL效應因子AvrBs3于1989年在野油菜辣椒斑點病菌中被發(fā)現(xiàn)[34]。TAL效應因子含有串聯(lián)重復的核心結構域、核定位信號(Nuclear localization signal，NLS) 和轉錄激活區(qū)(Acidic activation domain，AD)[35-37]，其中串聯(lián)重復的核心結構域具有特異性識別和結合DNA的功能，每個串聯(lián)重復單元通常由34個氨基酸組成，且不同單元的氨基酸序列高度保守，僅在12位和13位氨基酸上存在差異，被稱為重復可變雙氨基酸殘基(Repeat variable di-residue，RVD)[38]。RVD決定了重復單元的DNA識別特異性：Asn/Ile (NI) 識別A，Asn/Gly (NG) 識別T，His/Asp (HD) 識別C，Asn/Asn (NN) 識別G和A，Asn/Lys (NK) 識別G[37-40]。TAL串聯(lián)重復結構域中的RVD與靶標DNA序列之間的對應關系，使得TAL效應子的串聯(lián)重復單元可以替換ZFN的DNA識別元件，從而發(fā)展了新型的基因定點編輯工具TALEN[41-44]。

與ZFN技術相比，TALEN基因編輯技術具有更高的DNA識別特異性，同時TALEN的靶標位點設計靈活方便，模塊組裝具有極大的便捷性。目前科研人員利用TALEN技術已成功實現(xiàn)對煙草、水稻等多種植物的基因編輯[2,32]，并創(chuàng)制出對白粉病具有廣譜抗性的小麥材料[45]。

1.3 MGN基因編輯技術

MGN基因編輯技術也是一種基因工程改造的核酸酶技術，MGN是一種能夠識別大于12個堿基長度特異核酸序列的歸巢核酸內(nèi)切酶，包含保守的DNA結合結構域和酶切活性結構域，廣泛存在于生物體體內(nèi)[46]。通過對MGN的DNA結合結構域進行改造，可以實現(xiàn)特異性目標DNA序列的識別并進行基因編輯[10]。

與ZFN或TALEN不同，歸巢核酸內(nèi)切酶識別的目標DNA序列較長且具有很強的特異性，因此MGN改造起來難度較大，任何DNA結合結構域的改變都有可能影響目標DNA序列的識別和切割。由于MGN的基因工程改造成本較高，MGN技術的研發(fā)和應用主要集中在生物公司。目前已有研究報道MGN技術可應用于玉米等作物的基因組修飾[47]。

1.4 CRISPR/Cas基因編輯技術

CRISPR/Cas是細菌和古細菌在長期進化過程中應對外來病毒和DNA入侵而形成的一種免疫應答反應系統(tǒng)[48-54]。1987年大阪大學(Osaka University) 的研究人員報道了細菌基因組中存在成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(CRISPR)[52]，隨后發(fā)現(xiàn)在CRISPR附近區(qū)域還存在高度保守的CRISPR相關蛋白Cas[53]，并證明Cas蛋白具有核酸酶活性，可以對DNA序列進行特異性切割[54]。CRISPR/Cas系統(tǒng)通過將入侵的噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR序列中，并利用CRISPR RNA (crRNA) 來指導同源序列的降解。根據(jù)功能元件的不同，可以將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ三種類型，其中TypeⅡ類型CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為簡單，由pre-crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白構成[12]，該系統(tǒng)的作用原理是tracrRNA與pre-crRNA結合，隨后在Cas9存在的條件下，RNase Ⅲ完成對pre-crRNA/tracrRNA的切割，進而形成成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9復合體對靶位點DNA序列進行剪切，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂[13-14]。

2012年Jinek等將tracrRNA和crRNA表達為一條嵌合的向導RNA (Single guide RNA，sgRNA)，并在體外證明sgRNA可以發(fā)揮tracrRNA和crRNA的功能[55]。改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由sgRNA和Cas9蛋白構成，Cas9在sgRNA的指引下對基因組的PAM基序(Protospacer adjacent motifs) 上游進行定點切割[12]。通常PAM位點由3個保守的核苷酸NGG (N可以為任何氨基酸)[13]組成。由于CRISPR的sgRNA識別序列一般僅需20個核苷酸左右，且Cas9蛋白不需要形成蛋白二聚體起作用，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)與ZFN、TALEN和MGN等技術相比具有構建簡單、編輯高效等優(yōu)點，目前已廣泛應用于動植物等基因組編輯研究[12,14,56]。圖1所示為ZFN、TALEN、MGN以及CRISPR/Cas9技術的原理示意圖。此外，由于Cas9能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造和應用潛力[14]。

圖1 ZFN、TALEN、MGN以及CRISPR/Cas9基因編輯技術原理示意圖

2 CRISPR/Cas9技術在植物中的研究進展

2.1 基因定點敲除

CRISPR/Cas基因編輯技術一經(jīng)面世就受到植物科學家的廣泛關注。2013年雜志同時報道利用CRISPR/Cas9技術可以在雙子葉植物擬南芥、煙草和單子葉作物水稻、小麥中成功實現(xiàn)基因編輯。Li等和Nekrasov等研究人員分別利用植物密碼子優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)對擬南芥和煙草中的基因進行定點敲除，同時發(fā)現(xiàn)煙草的編輯效率明顯高于擬南芥[57-58]，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)對于不同植物的編輯效率存在差異。Shan等科研人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別定點突變了水稻和小麥兩個作物中的和等5個基因，并且在T0代獲得了水稻純合突變體，呈現(xiàn)預期的白化和矮小表型，該研究證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應用于水稻等單子葉作物的基因組編輯[59]。此后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被陸續(xù)報道成功應用于擬南芥、煙草、水稻、小麥、玉米、高粱、番茄等多種植物和農(nóng)作物中[15-23]。表1所示為本文中介紹的CRISPR/Cas9技術在一些主要植物和作物中的應用情況。

2.2 基因定點插入和替換

利用基因編輯技術實現(xiàn)基因組水平的基因定點插入和精確替換對于植物遺傳改良具有重要的應用意義。2015年Svitashev等和Li等利用CRISPR/Cas9技術分別在玉米和大豆中實現(xiàn)基因定點插入和替換[17,60]。2016年，中國科學院遺傳與發(fā)育研究所的研究人員通過非同源末端修復(NHEJ) 途徑開發(fā)了一種內(nèi)含子介導的位點特異性基因定點插入和替換方法，通過使用一對靶向相鄰內(nèi)含子的sgRNA和包含同一對sgRNA位點的供體DNA模板，在水稻中實現(xiàn)了5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase，EPSPS) 基因的定點替換[61]。該研究拓展了CRISPR/Cas9技術在植物中的應用，為植物基因功能的解析和農(nóng)作物分子設計育種提供了一個全新的技術路線。

2.3 多基因敲除

作物的重要農(nóng)藝性狀通常受到多基因調控，因此開發(fā)多基因CRISPR定點編輯技術對于解析作物重要農(nóng)藝性狀形成的遺傳基礎非常重要。Li等利用擬南芥原生質體系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9可以實現(xiàn)多基因敲除[57]。Xing等于2014年開發(fā)了基于pGreen或pCAMBIA骨架的CRISPR/Cas9載體，可以在1個克隆步驟中同時產(chǎn)生Cas9蛋白和1個或多個gRNA的表達載體，并利用該套CRISPR載體成功獲得可以穩(wěn)定遺傳的多基因敲除突變體，表明CRISPR/Cas9技術可以應用于植物的多基因編輯[62]。2015年，Ma等設計出了一種基于PCR的方式來快速構建多個sgRNA表達盒，并采用Golden Gate ligation或Gibson Assembly連接方法在一輪克隆中將表達盒裝配到CRISPR/Cas9雙元載體中[63]，研究人員利用該系統(tǒng)在水稻中成功編輯了46個靶位點，突變率平均為85.4%，其中大多數(shù)為純合突變和雙等位基因突變(Biallelic mutation)；同時在雙子葉植物擬南芥中利用該多基因表達載體在T1代獲得了雙重雜合、純合和嵌合突變，并證實在水稻和擬南芥中的上述突變位點都可以穩(wěn)定遺傳[63]。上述工作為研究植物基因家族功能以及創(chuàng)制多基因突變體提供了一個重要的研究工具。

2.4 基因單堿基精確突變

基因敲除是解析植物基因功能的重要研究手段，然而在植物研究中發(fā)現(xiàn)，一些單核苷酸點突變是作物許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的遺傳基礎。2016年，美國哈佛大學的Komor等對CRISPR/Cas9技術進行定向改進，構建出一種新型的“堿基編輯” (Base editor，BE) 系統(tǒng)[64]。研究人員首先突變Cas9蛋白使其喪失DNA雙鏈切割活性但保持其DNA雙鏈的解旋功能(BE1)；隨后把可以將胞嘧啶(C) 轉變?yōu)槟蜞奏?U) 的大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合到突變的Cas9蛋白N端，同時將尿嘧啶DNA糖基酶抑制劑(Uracil DNA glycosylase inhibitor，UDI) 連接到APOBEC1-CRISPR/dCas9融合蛋白的C端(BE2)，實現(xiàn)單堿基的精確轉變；為進一步提高點突變的編輯效率，研究人員利用了哺乳動物細胞中固有的錯配修復(Mismatch repair，MMR) 機制，通過定點突變恢復Cas9蛋白的DNA單鏈切割活性(BE3)，最終實現(xiàn)高效的基因單堿基精確突變[64]。2016年，Li等通過利用胞嘧啶脫氨酶、Cas9 (D10A) 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI) 的融合蛋白(BE3)，構建植物表達載體，成功對水稻和基因進行單堿基定點替換，效率最高可達20%左右[65]。最近，Zong等利用Cas9變體(nCas9-D10A) 融合大鼠胞嘧啶脫氨酶(rAPOBEC1) 和UGI，構成了高效的植物單堿基編輯系統(tǒng)nCas9-PBE，成功地在水稻、小麥和玉米等農(nóng)作物基因組中實現(xiàn)高效、精確的單堿基定點突變[66]，該項技術不需要外源DNA供體和雙鏈DNA的切割，具有簡單、廣適、高效的特點，為高效和大規(guī)模創(chuàng)制單堿基突變體提供了一個可靠方案。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術在苜蓿等豆科飼草作物中的應用

紫花苜蓿是世界著名優(yōu)良牧草，也是我國栽培面積最大的一種豆科飼料作物，由于其具有蛋白質豐富、適應性強、能改良土壤和經(jīng)濟價值高等優(yōu)點而享有“牧草之王”的美譽。但由于紫花苜蓿是多年生同源四倍體牧草，蟲媒傳粉，其復雜的遺傳特性使得紫花苜蓿與二倍體作物相比在重要性狀基因挖掘及遺傳改良方面的研究工作相對滯后。蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生放牧型牧草，二倍體，與紫花苜蓿、黃花苜蓿、三葉草等豆科飼草具有高度的遺傳相似性，隨著蒺藜苜蓿全基因組測序的完成，蒺藜苜蓿已成為研究紫花苜蓿等豆科牧草遺傳學和功能基因組學的理想模式[67]。

與水稻、小麥、玉米、大豆等主要糧食作物和經(jīng)濟作物相比，目前關于CRISPR/Cas9基因編輯技術在苜蓿等豆科飼草作物中的應用研究非常有限。為研究CRISPR/Cas9基因編輯技術在大豆等豆科作物中的應用，美國明尼蘇達大學的研究人員開發(fā)了一個可以預測CRISPR/Cas9目標位點的網(wǎng)頁工具，在此基礎上，利用大豆密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白構建了一個同時包含sgRNA的CRISPR/Cas9載體，并通過根毛轉染的方法分別轉化大豆和豆科模式牧草蒺藜苜蓿，分子檢測發(fā)現(xiàn)在大豆和蒺藜苜蓿的根毛轉化細胞中靶標基因出現(xiàn)一系列的突變[68]。2016年，Wang等在豆科模式植物百脈根中利用CRISPR技術成功實現(xiàn)、和的多基因敲除，導致百脈根產(chǎn)生白色根瘤[69]。最近，我們實驗室利用蒺藜苜蓿特異表達的U6啟動子結合密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白建立了1個適用于農(nóng)桿菌介導的苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功對蒺藜苜蓿的內(nèi)源基因進行了定點敲除，在T0代得到了比例達到10.35%的具有白化表型的蒺藜苜蓿純合敲除突變體[70]。上述研究工作為苜蓿等豆科植物功能基因組學研究提供了重要的研究工具，同時為CRISPR/Cas9技術應用于紫花苜蓿等具有復雜基因組豆科飼草作物的遺傳改良提供研究思路和技術參考。

4 展望

隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展，人民生活水平日益提高，廣大城鄉(xiāng)居民的飲食結構發(fā)生了很大改變，居民口糧消費逐漸下降，對牛羊肉、禽肉和奶制品等草食畜產(chǎn)品的消費不斷加大，進而對苜蓿等優(yōu)質飼草料的需求與日俱增。目前我國苜蓿等優(yōu)質草種和飼草產(chǎn)品缺口較大，無法滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)的消費需要，導致苜蓿大量進口，對我國的飼料產(chǎn)業(yè)和畜產(chǎn)品安全造成嚴重威脅。

通過分子育種與傳統(tǒng)育種相結合，加快培育高產(chǎn)優(yōu)質苜蓿新品種，對于解決我國飼料作物生產(chǎn)和畜產(chǎn)品安全等問題至關重要。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興的基因編輯技術，由于其具有操作簡單靈活、編輯特異高效等特點，并且可以同時對多個基因進行高效精確定點修飾，目前已在植物基因定點編輯方面得到了大量應用，然而CRISPR/Cas9系統(tǒng)在使用上仍存在著一定的局限性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作時需要將crRNA與tracrRNA融合在一起，并且需要在宿主RNA酶的幫助下才能發(fā)揮作用。最近，Zetsche等發(fā)現(xiàn)并改造出新型CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，克服了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的上述局限，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不需要tracrRNA的輔助，并且Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶雙重功能，不但可以切割DNA雙鏈，而且能把非成熟型crRNA (pre-crRNA)加工剪切為成熟型crRNA[71]，目前科研人員利用該系統(tǒng)可簡單高效地在動植物中實現(xiàn)多基因敲除，進一步拓展了CRISPR技術的應用[71-73]。相信隨著CRISPR/Cas基因編輯技術的不斷發(fā)展和完善，未來基因編輯技術將在農(nóng)作物，尤其是飼草作物的產(chǎn)量、品質和抗性等重要性狀的基因功能解析和遺傳改良中發(fā)揮更大的作用。

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(本文責編 陳宏宇)

Genome editing technology and its application in forage legumes

Huan Liu, Yingying Meng, Lifang Niu, and Hao Lin

Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Genome editing is a novel targeted genome modification biotechnology, which could successfully mutate specific loci as well as generate gene replacement and insertion in various organisms. So far, genome editing technology has been widely applied in investigating gene function and developing valuable traits in both model plants and major crops. In this review, we briefly survey the historical development of genome editing technology, summarize recent progress using the CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and explore the potential of the CRISPR/Cas technology in improving forage legumes.

genome editing, CRISPR/Cas9, forage legumes,

April 24, 2017;

June 12, 2017

Hao Lin. Tel: +86-10-82105492; E-mail: linhao@caas.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31570309), Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences (No. Y2016JC30).

國家自然科學基金(No. 31570309)，中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(No.Y2016JC30) 資助。

林浩 博士，中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所研究員、博士生導師。主要從事飼草作物功能基因組學和遺傳改良研究，在苜蓿重要農(nóng)藝性狀控制基因的挖掘和功能解析方面取得重要進展，并成功應用于飼草作物的遺傳改良，相關研究成果發(fā)表在、、等國際主流學術期刊。入選首批中國農(nóng)業(yè)科學院“青年英才計劃”，擔任中國草學會草業(yè)生物技術專業(yè)委員會理事。