李紅，謝卡斌

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植物CRISPR基因組編輯技術(shù)的新進展

李紅，謝卡斌

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室，湖北武漢 430070

李紅, 謝卡斌. 植物CRISPR基因組編輯技術(shù)的新進展. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(10): 1700–1711.Li H, Xie KB.Recent progresses in CRISPR genome editing in plants. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1700–1711.

在過去的4年中，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的革命性工具，為植物學(xué)基礎(chǔ)研究和農(nóng)作物遺傳改良提供了高效、快速而又廉價的遺傳操作工具。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實現(xiàn)精準的knock-out和knock-in等遺傳操作，也可用于靶向激活或抑制基因的表達。在CRISPR/Cas9被廣泛地用于基因組編輯的同時，它的編輯能力、效率和精確度也在不斷地改進和完善，特別是CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的發(fā)掘和單堿基編輯技術(shù)的創(chuàng)建，使CRISPR系統(tǒng)正逐步成為一個理想的遺傳工程技術(shù)平臺。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)改良的農(nóng)作物品種也已經(jīng)涌現(xiàn)，這必將推動精準基因組編輯技術(shù)在農(nóng)作物遺傳改良中的應(yīng)用和發(fā)展。

CRISPR/Cas9，農(nóng)作物，靶向基因，遺傳改良，進展

基因組包含了生物生長發(fā)育和生理功能的全部遺傳信息，是開展生物學(xué)研究的出發(fā)點。近10年來，隨著新一代DNA測序技術(shù)的發(fā)展，基因組測序的成本下降了近萬倍(https://www. genome.gov/sequencingcostsdata)，越來越多的農(nóng)作物完成了高質(zhì)量的參考基因組的繪制。因此，“讀懂”基因組序列的“含義”并將之用于農(nóng)作物改良成為“后功能基因組學(xué)”時代植物學(xué)研究的主要任務(wù)。植物基因功能的解析和農(nóng)作物的遺傳改造需要進行各種遺傳操作(Genetic modification)。在過去的20年中，物理化學(xué)誘變、T-DNA插入突變和基于RNAi、artificial microRNA的靶向基因抑制技術(shù)被廣泛地用于擬南芥、水稻等模式生物的基因功能解析[1-2]。自2010年TALEN (Transcription activator like effector nuclease)技術(shù)和2013年CRISPR/Cas9 (Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9 system) 技術(shù)用于基因組編輯以來，對不同農(nóng)作物進行遺傳操作的能力有了前所未有的提高。這些技術(shù)不僅推動了生物學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，而且在疾病治療、農(nóng)作物育種、生物能源等方面都展現(xiàn)出巨大的潛力和產(chǎn)業(yè)化價值[3]。

基因組編輯技術(shù)就是利用人工設(shè)計和改造的核酸酶對基因組進行精確的定點修飾，包括對基因組進行靶向基因敲入(Knock-in)、基因功能敲除(Knock-out) 以及有目的的片段替換[4]。CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)為生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了簡單、強大的基因組編輯平臺，因此迅速成為遺傳操作的主流工具。同時，CRISPR/Cas9也一直以前所未有的速度發(fā)展和更新。本文旨在簡要介紹CRISPR/Cas9相關(guān)技術(shù)的原理，重點介紹近兩年出現(xiàn)的與植物相關(guān)的新技術(shù)，以及CRISPR/Cas9用于農(nóng)作作物遺傳改良的潛力及其面臨的挑戰(zhàn)，為CRISPR/Cas9在農(nóng)作物中的應(yīng)用提供有益的參考。

1 CRISPR/Cas9靶向基因編輯的原理

1.1 CRISPR/Cas9的工作原理

CRISPR/Cas是細菌和古細菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能特異地降解入侵噬菌體或外源質(zhì)粒的DNA，其中CRISPR是“成簇和規(guī)律間隔的短回文序列”的簡稱，而Cas是指與CRISPR RNA結(jié)合的蛋白。在2012年，Jinek等解開了化膿鏈球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機制，并證明Cas9核酸酶(本文專指的Cas9)可以在一個人造的小RNA分子(稱為gRNA，即Guide RNA) 的引導(dǎo)下去靶向切割DNA雙鏈[5]。利用Cas9/gRNA標靶特定的DNA位點只需滿足2個條件(圖1A)：1) gRNA的5′端20 nt (Nucleotides) 的引導(dǎo)序列(稱為Spacer或Guide sequence) 與靶DNA位點的序列 (稱為Protospacer)互補匹配；2) 靶位點必須存在PAM (Protospacer- adjacent motif)，其中使用最廣的化膿鏈球菌Cas9的PAM序列為5′-NGG-3′。在使用CRISPR/Cas9進行基因組編輯時，一般用Pol Ⅱ (RNA polymeraseⅡ，Ⅱ型RNA聚合酶) 啟動子表達含核定位信號的Cas9，用Pol Ⅲ (RNA polymerase Ⅲ) 啟動子表達gRNA，Cas9/gRNA復(fù)合體識別靶DNA后在PAM前面的第3個和第4個脫氧核酸之間切割DNA雙鏈，形成DSB (Double stranded DNA break，雙鏈DNA斷裂)。與早期的TALEN和鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease) 兩種靶向DNA技術(shù)相比[6]，Cas9/gRNA更容易操作和實現(xiàn)，成本也更低，因此迅速成為主流的基因組編輯工具。

1.2 CRISPR/Cas9的應(yīng)用概況

1.2.1 基因組序列編輯

CRISPR/Cas9靶向編輯基因組序列的原理是利用Cas9和靶位點特異的gRNA切割基因組，在設(shè)計的靶位點處形成DSB (Double strand break)，然后利用生物體內(nèi)的DSB修復(fù)過程來對DNA序列進行修改(圖1A)。

1) 靶向基因敲除(Knock-out)。如圖1A所示，Cas9和gRNA在切割靶位點后，形成的DSB主要以NHEJ (Non-homologous end joining)的方式進行修復(fù)，而NHEJ是一種易出錯的修復(fù)方式，會在DSB的位置引入小的核酸插入或缺失(Insertion and deletion，indel)。Indel的引入造成靶基因蛋白翻譯產(chǎn)生移碼，從而破壞基因功能?；贑RISPR/Cas9的靶向基因敲除技術(shù)最早在擬南芥、水稻、煙草、小麥、大麥、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄等模式植物和重要農(nóng)作物中建立[7-12]，隨后在各種不同的植物中都得到了驗證[13]。通過對CRISPR/Cas9編輯過的水稻和擬南芥材料進行多代觀察和基因型檢測，結(jié)果表明CRISPR/Cas9產(chǎn)生的突變可以穩(wěn)定遺傳到后代植株[14-16]。除了通過引入indel外來敲除基因功能外，CRISPR/Cas9還可以用來對染色體進行其他的遺傳操作。比如，用Cas9和一對gRNA來精確地刪除一段染色體DNA (圖1B)。在染色體上靶向切除特定片段對非編碼RNA或啟動子區(qū)(如microRNA或-element) 的研究具有重要價值，因為這些區(qū)域很難通過小的indel來破壞其功能。此外，CRISPR/Cas9甚至能用來創(chuàng)建染色體異常(如大片段缺失、易位、倒位) 的突變體。比如，Zhou等利用CRISPR/Cas9和一對gRNA從水稻染色體上刪除了1個115–245 kb (Kilo base pairs) 大片段，其中包含了2–3個不同的基因簇[17]。在過去的4年中，CRISPR/Cas9靶向基因敲除已迅速成為植物研究中最流行的反向遺傳學(xué)研究工具。

2) 靶向基因敲入/替換(Knock-in)。在植物的染色體上定點插入或替換(Knock-in) 一段序列一直是一個難以攻克的技術(shù)難題，而TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)極大地降低了這一技術(shù)的難度。Knock-in依賴的是DSB的同源重組修復(fù)(Homology-directed repair，HDR) 修復(fù)途徑(圖1A)：當Cas9/gRNA切割靶位點后，如果細胞中有與靶位點序列同源的DNA供體(DNA donor) 片段時，位于供體DNA上的基因片段會通過HDR重組整合到DSB的位置[11,18-21]。雖然植物原生質(zhì)體中可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)來實現(xiàn)Knock-in或靶向基因替換，但很難在穩(wěn)定的植株獲得成功。

目前，有兩種比較通用的策略可用于提高植物knock-in的效率。一是利用小麥矮縮病毒W(wǎng)DV (Wheat dwarf virus) 為DNA donor的載體，通過提高donor DNA的拷貝數(shù)，從而大幅度地提升Knock-in的效率[21]。這一策略在兩種主要農(nóng)作物水稻[22]和小麥[23]中得到了驗證，特別是在水稻中Knock-in的效率最高可達19.4%。二是利用Cas9和一對gRNA從DNA donor上“剪切”一段序列后，再“粘貼”到植物基因組的靶位點上。這一策略利用的是主導(dǎo)DSB修復(fù)的NHEJ通路。在2016年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的高彩霞和李家洋實驗室合作，通過巧妙的靶位點設(shè)計，在水稻中利用CRISPR/Cas9實現(xiàn)了這一“剪切/粘貼”式的靶向基因敲入和替換[24]。在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上，這些新的策略為knock-in高效率地用于植物遺傳改造提供了可能。

1.2.2 靶向基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

除基因組編輯功能以外，CRISPR技術(shù)的高擴展性保證了這一技術(shù)可以與多種功能蛋白融合而行使其他遺傳操作。這一技術(shù)的核心是借助gRNA靶向基因組上特定位點的能力，利用dCas9 (Dead Cas9，無DNA切割活性的Cas9) 和gRNA將不同功能的效應(yīng)蛋白運輸?shù)饺旧w上的特定位置發(fā)揮功能(圖1C)。比如，將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation domain, AD) 融合，利用gRNA將dCas9-AD引導(dǎo)到啟動子區(qū)域后就可以實現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。在這一技術(shù)中，往往需要多個gRNA同時靶向目的基因的啟動子才能有效提高靶基因的表達[25-28]。而另一個精妙設(shè)計的策略解決了這個問題：將gRNA scaffold作為招募轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件的平臺來調(diào)控靶基因的表達。例如，將MS2 (RNA配體)融合gRNA，而MS2的特異結(jié)合蛋白MCP融合AD片段，這樣dCas9/gRNA-MS2/MCP-AD的復(fù)合體靶定在目的基因啟動子上激活轉(zhuǎn)錄。這一技術(shù)的巧妙之處在于可以將多個MS2整合在gRNA scaffold序列中，從而使用單個gRNA就能招募多個MCP-AD來有效地激活靶基因表達[29-30]。與基于CRISPR/Cas9靶向基因轉(zhuǎn)錄激活類似，將不同的功能蛋白(轉(zhuǎn)錄抑制、表觀遺傳修飾的蛋白元件) 用于dCas9/gRNA這一平臺，就可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制或表觀調(diào)控等不同的遺傳操作[26,30]。這些基因組編輯相關(guān)的衍生技術(shù)為生物學(xué)研究提供了更豐富、更便利的遺傳學(xué)工具。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的主要應(yīng)用

2 CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化

2.1 降低CRISPR/Cas9的脫靶

脫靶一直是CRISPR/Cas9技術(shù)的主要困擾。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)誕生之際，即有報道Cas9/gRNA在動物細胞系中存在脫靶效應(yīng)：一些與gRNA引導(dǎo)序列不完全匹配的DNA位點(脫靶位點) 也會被Cas9脫靶編輯[31-32]，引入非預(yù)期的基因突變(Off-target effects)[33-35]。脫靶效應(yīng)的存在便成為了CRISPR/Cas9最大的不足。為了解決這個問題，科學(xué)家們作出了很多積極的嘗試。在早期的研究中，將Cas9點突變(D10A或者H804A) 后修飾為切口酶(Cas9 nickase，Cas9n) 或者將dCas9與Ⅰ融合為 1個切口酶，這樣需要設(shè)計1對gRNA靶定1個位點才能形成DSB，將脫靶的概率降低了幾個數(shù)量級[36-38]。也有研究表明縮短gRNA的引導(dǎo)序列至17–18 nt可以降低脫靶風險[39]；或者將Cas9蛋白與其他DNA-binding結(jié)構(gòu)域融合也可以有效地降低脫靶率[40]。這些策略雖然大大降低了脫靶效應(yīng)，但是也將這項技術(shù)復(fù)雜化，而且并沒有從本質(zhì)上改進Cas9的特異性。隨著Cas9/gRNA復(fù)合體的結(jié)構(gòu)被解析，研究者們設(shè)計出具有高切割活性和高特異性的Cas9變異體，這些“高保真”版本的Cas9對DNA與gRNA間堿基錯配是零容忍的，可用來實現(xiàn)精準的遺傳操作[41-45]，基本上解決了對CRISPR/Cas9脫靶問題的困擾。

在植物CRISPR/Cas9基因編輯試驗中，脫靶現(xiàn)象并沒有動物中的嚴重，但也發(fā)現(xiàn)了個別脫靶編輯的現(xiàn)象，這可能是由于靶位點設(shè)計時未使用高特異性的gRNA引起的[46]。全基因組序列分析的結(jié)果表明，擬南芥、水稻等基因組小、序列重復(fù)性不高的物種中，完全可以設(shè)計出足夠的高特異性gRNA來編輯90%的基因[47]。目前已有許多生物信息學(xué)工具可以用于脫靶分析、設(shè)計低脫靶概率的gRNA，如CRISPR-PLANT[47]、E-CRISP[48]、CRISPR-P[49]等。通過設(shè)計高特異性的gRNA或使用新型“高保真”版本的Cas9，可望有效地消除CRISPR/Cas9脫靶現(xiàn)象對植物基因組編輯的影響。

2.2 優(yōu)化gRNA的表達

CRISPR/Cas9簡單、強大的多位點編輯能力是其顯著優(yōu)點之一。實現(xiàn)多位點編輯需要同時表達多個gRNA分子，目前主要有3種策略來利用1個載體同時表達多個gRNA。一是在質(zhì)粒載體中克隆多個表達單元，每個單元含1個Pol Ⅲ啟動子和gRNA[50-51]。第二種是利用Csy4核酸酶將含多個gRNA的轉(zhuǎn)錄本切割成單個的gRNA，其中g(shù)RNA之間用Csy4的RNA底物連接起來[52]。三是將生物體的內(nèi)源轉(zhuǎn)運RNA (Transfer RNA，tRNA) 與gRNA融合，將多個 tRNA-gRNA結(jié)構(gòu)串聯(lián)排列為1個多順反子，利用生物體內(nèi)的tRNA加工酶來將此多順反子切割成成熟的gRNA，實現(xiàn)多位點編輯[53]。除此之外，具有自我切割功能的核酶(Self-cleavage ribozyme) 也可以用于多個gRNA的表達[54-55]。這些不同方法為植物遺傳操作提供了成熟的多位點CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)。

2.3 降低PAM的限制

DNA靶位點必須存在PAM是限制CRISPR/Cas9用于基因組編輯的主要因素。根據(jù)幾種模式植物的參考基因組的序列分析，一般基因組上平均每100 bp有6?11個PAM (5′-NGG-3′)。這一出現(xiàn)頻率雖然已基本能夠滿足常規(guī)基因功能研究的需要，但是極大地限制了CRISPR/Cas9的應(yīng)用范圍。

為了消除或減弱PAM依賴性對CRISPR/Cas9的限制，需要尋找或創(chuàng)建識別不同PAM序列的CRISPR/Cas9用于基因組編輯。在過去的3年，已有多個CRISPR/Cas9系統(tǒng)被發(fā)掘出來[56-57]，極大地擴展了CRISPR/Cas靶向基因編輯的空間。此外，研究人員通過對最常用的化膿鏈球菌的Cas9進行工程改造，修改Cas9蛋白中與PAM識別相關(guān)的氨基酸位點，得到了識別5′-NGAN-3′和5′-NGNG-3′等不同PAM序列的Cas9突變體[58]，并已經(jīng)用于植物基因組編輯[59]。綜合這些新進展，已有的CRISPR/Cas9工具基本具備了靶向全基因組的能力。

3 超越CRISPR/Cas9

3.1 靶向單堿基編輯

在基因組編輯技術(shù)中，最常見的應(yīng)用是通過CRISPR/Cas9在靶位點引入indel，從而破壞靶基因的功能。但在農(nóng)作物遺傳改良的實踐中，很難通過完全破壞基因功能來獲得有育種或應(yīng)用價值的材料，更多的是需要定向修改單個或幾個堿基來改變基因的功能，從而定向改良作物的農(nóng)藝性狀。因此，高效率定向轉(zhuǎn)換基因組的序列是CRISPR/Cas9技術(shù)用于遺傳改良實踐的關(guān)鍵，而單堿基編輯技術(shù)正滿足了這一需求。

基于CRISPR/Cas9靶向編輯單個堿基的原理如圖1D所示，將Cas9n (或dCas9) 與胞嘧啶脫氨酶(Cytidine deaminase) 融合，當gRNA引導(dǎo)融合蛋白到靶位點時，靶位點附近的胞嘧啶C被脫氨酶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶U，而U與胸腺嘧啶T的具有相同的堿基配對規(guī)則，在DNA復(fù)制或修復(fù)時U會轉(zhuǎn)換為T，從而完成C→T的堿基轉(zhuǎn)換[60-63]。為了提高C→U→T的效率，在編輯工具中會加入相關(guān)元件來抑制U→C的回復(fù)修復(fù)。目前已有2個構(gòu)建成功的單堿基編輯工具：一是美國麻省理工大學(xué)的David Liu實驗室構(gòu)建的BE (Base editor) 系統(tǒng)——由dCas9或Cas9n與哺乳動物的脫氨酶APOBEC1融合而得到[60]；二是dCas9或Cas9n與AID (Activation-induced deaminase)融合得到的Target-AID[61]、CRISPR-X[62]和TAM[63]系統(tǒng)。這些不同的單堿基編輯工具在具體的設(shè)計上略有差別，能夠編輯的靶堿基的窗口也稍有不同，但在動物細胞中都能實現(xiàn)高效率的C→T單堿基替換。

雖然利用Cas9介導(dǎo)的knock-in也可以實現(xiàn)單堿基的替換，但HDR的效率和實現(xiàn)的難易程度與BE、Target-AID/TAM/CRISPR-X等單堿基編輯工具無法比擬。在哺乳動物細胞系中同時編輯和兩個基因上的單個堿基時，Cas9介導(dǎo)的HDR的堿基轉(zhuǎn)換效率最高不超過0.3%，而BE3系統(tǒng)的效率達到了驚人的58%?75% () 和3%?8% ()[60]。最新的結(jié)果也表明，利用CRISPR/Cas9改造的單堿基編輯工具特異性非常高，沒有檢測到脫靶編輯[64]。這些CRISPR單堿基編輯工具，將基因編輯技術(shù)推向了一個新的高度，為CRISPR/Cas9技術(shù)用于臨床治療、基礎(chǔ)研究及作物遺傳改良奠定了重要基礎(chǔ)。

由于單堿基編輯在作物遺傳育種中有巨大的應(yīng)用潛力，因此這些編輯技術(shù)被迅速地應(yīng)用到農(nóng)作物中[65-68]。比如將BE (Cas9n-APOBEC1)用于水稻、小麥和玉米，可以在protospacer的3?9 bp的編輯窗口中實現(xiàn)C→T的精確替換，效率最高可達到43.48%[66]。而把Target-AID用在水稻中，通過對(Acetolactate Synthase) 基因進行單堿基替換，獲得了耐除草劑的水稻材料[65]。這些成功的示例初步展示了CRISPR/Cas9單堿基編輯的巨大潛力。

3.2 基于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)

來自化膿鏈球菌的CRISPR/Cas9用于基因組編輯的巨大成功促使研究人員尋找和改造其他的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來擴充基因編輯工具箱，目前最具潛力的是CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，被認為是新一代基因組編輯工具中的佼佼者。2015年美國麻省理工大學(xué)的Zhang Feng實驗室首先發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)第5亞家族的成員Cpf1核酸內(nèi)切酶，并證實了來自氨基酸球菌屬、毛螺科菌屬和弗朗西斯氏菌屬的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1三個高度同源蛋白都具有RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶的活性，而且AsCpf1和LbCpf1用于動物的基因組編輯效率接近原來的CRISPR/Cas9系統(tǒng)[44]。

與Cas9比較，Cpf1在基因組編輯中具有以下幾個優(yōu)勢：1) Cpf1的引導(dǎo)RNA更短，但引導(dǎo)序列(即DNA靶位點) 更長(~24 nt)；2) Cpf1的特異性優(yōu)于Cas9，在脫靶分析實驗中沒有檢測到Cpf1的脫靶現(xiàn)象[69]；3) Cpf1可以將CRISPR RNA array切割成多個引導(dǎo)RNA，更容易實現(xiàn)多位點編輯[70-71]；4) Cpf1識別的PAM為5′-TTTN-3′ (AsCpf1和LbCpf1) 和5′-TTN-3′ (FnCpf1)，極大地擴充了基因組編輯的范圍；5) Cpf1在遠離PAM的protospacer區(qū)形成5個堿基突出(Overhang) 的切口，形成的突變類型與Cas9不同，更易于引入indel，從而提高knock-out的效率。

Cpf1的這些特點使其在基因組編輯中更具優(yōu)勢。因此基于CRISPR/Cpf1的基因編輯系統(tǒng)迅速被用于水稻和擬南芥等模式生物的基因組編輯和靶向基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[72-78]。水稻中利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)靶向基因敲除的效率與原有CRISPR/Cas9技術(shù)沒有顯著差別。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)簡單易行的多基因編輯能力也在水稻中得到了驗證[79]。此外，CRISPR/Cpf1也可以改造為靶向基因調(diào)控的工具，在擬南芥中實現(xiàn)了靶向基因表達抑制[73]?？偟膩碚f，CRISPR/Cpf1將是媲美甚至超越CRISPR/Cas9的植物基因組編輯平臺。

4 基因組編輯用于農(nóng)作物遺傳改良

雖然CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成為植物遺傳操作首選工具的時間很短，但在農(nóng)作物的遺傳改良中已展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用價值[80]。比如在小麥中，利用基因組編輯技術(shù)精確地靶向突變基因的3個拷貝，直接獲得了對白粉病具有廣譜抗性的小麥材料[81]；在水稻中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在溫敏核雄性不育基因中引入了特異性突變，并開發(fā)了新的不育系材料[82]，有望加速溫敏核雄性不育系在水稻雜交育種中的應(yīng)用。CRISPR/Cas9也被植物學(xué)家們改造為抵抗病毒的新工具，在擬南芥、煙草中利用Cas9和靶向雙生病毒的gRNA，實現(xiàn)了植物對靶病毒的免疫[83-85]。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的快速擴張，越來越多基因編輯的農(nóng)作物將進入實際應(yīng)用階段。

DNA-free基因組編輯技術(shù)的建立和成熟，將進一步推動CRISPR/Cas9技術(shù)用于農(nóng)作物遺傳改良的步伐。DNA-free基因組編輯是指將預(yù)先體外表達的Cas9蛋白(或Cpf1) 和合成的gRNA直接轉(zhuǎn)入植物細胞完成對靶基因的編輯，然后將編輯的細胞再生出完整的植株。由于整個過程不涉及任何外源DNA，因此除了編輯的靶位點外，不會產(chǎn)生額外的遺傳修飾。此技術(shù)最早在擬南芥、煙草、萵苣和水稻4種植物體原生質(zhì)體中得到了驗證[86]。隨后，在玉米、小麥等關(guān)鍵糧食作物中建立了DNA-free的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[87-90]。DNA-free技術(shù)將有可能進一步消除公眾對基因組編輯農(nóng)作物的擔憂，有望加速CRISPR/Cas9技術(shù)在作物遺傳改良中的應(yīng)用。

基因組編輯作物的出現(xiàn)也促使監(jiān)管部門重新審視CRISPR/Cas9和TALEN等技術(shù)所改良的農(nóng)作物品種，特別是它們與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物間的不同。美國農(nóng)業(yè)部明確表示基因組編輯改良的蘑菇和土豆品種，由于最后產(chǎn)品中無外源DNA，因此可等同于傳統(tǒng)育種得到的農(nóng)作物品種[80,91]。在CRISPR/Cas9技術(shù)快速發(fā)展并被廣泛用于不同作物的今天，如何管理基因組編輯技術(shù)改良的農(nóng)作物新品種，將是一個重要的議題。

5 展望

CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)提供了一個簡單、廉價、精準的遺傳操作平臺，不僅能為基礎(chǔ)研究提供強大支持，也將加速功能基因組學(xué)研究成果向產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化，為農(nóng)作物遺傳改良注入新的動力。

[1] McCourt P, Benning C.: a rich harvest 10 years after completion of the genome sequence. Plant J, 2010, 61(6): 905–908.

[2] Zhang QF, Li JY, Xue YB, et al. Rice 2020: a call for an international coordinated effort in rice functional genomics. Mol Plant, 2008, 1(5): 715–719.

[3] Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262–1278.

[4] Voytas DF. Plant genome engineering with sequence-specific nucleases. Annu Rev Plant Biol, 2013, 64: 327–350.

[5] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816–821.

[6] van der Oost J. Molecular biology. New tool for genome surgery. Science, 2013, 339(6121): 768–770.

[7] Miao J, Guo DS, Zhang JZ, et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res, 2013, 23(10): 1233–1236.

[8] Feng ZY, Zhang BT, Ding WN, et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res, 2013, 23(10): 1229–1232.

[9] Xie KB, Yang YN. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Mol Plant, 2013, 6(6): 1975–1983.

[10] Jiang W, Zhou H, Bi H, et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res, 2013, 41(20): e188.

[11] Li W, Teng F, Li T, et al. Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 684–686.

[12] Mao YF, Zhang H, Xu NF, et al. Application of the CRISPR-cas system for efficient genome engineering in plants. Mol Plant, 2013, 6(6): 2008–2011.

[13] Bortesi L, Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol Adv, 2015, 33(1): 41–52.

[14] Feng ZY, Mao YF, Xu NF, et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(12): 4632–4637.

[15] Minkenberg B, Xie KB, Yang YN. Discovery of rice essential genes by characterizing a CRISPR-edited mutation of closely related rice MAP kinase genes. Plant J, 2017, 89(3): 636–648.

[16] Zhang H, Zhang JS, Wei PL, et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation. Plant Biotechnol J, 2014, 12(6): 797–807.

[17] Zhou HB, Liu B, Weeks DP, et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice. Nucleic Acids Res, 2014, 42(17): 10903–10914.

[18] Wang BM, Li KY, Wang A, et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques, 2015, 59(4): 201–202, 204, 206–208.

[19] Sun YW, Zhang X, Wu CY, et al. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase. Molecular Plant, 2016, 9(4): 628–631.

[20] Li JF, Norville JE, Aach J, et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis andusing guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 688–691.

[21] Baltes NJ, Gil-Humanes J, Cermak T, et al. DNA replicons for plant genome engineering. Plant Cell, 2014, 26(1): 151–163.

[22] Wang MG, Lu YM, Botella JR, et al. Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, doi: 10.1016/j.molp.2017.03.002.

[23] Gil-Humanes J, Wang YP, Liang Z, et al. High-efficiency gene targeting in hexaploid wheat using DNA replicons and CRISPR/Cas9. Plant J, 2017, 89(6): 1251–1262.

[24] Li J, Meng X, Zong Y, et al. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nat Plants, 2016, 2: 16139.

[25] Cheng AW, Wang HY, Yang H, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res, 2013, 23(10): 1163–1171.

[26] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013, 154(2): 442–451.

[27] Maeder ML, Linder SJ, Cascio VM, et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat Methods, 2013, 10(10): 977–979.

[28] Perez-Pinera P, Kocak DD, Vockley CM, et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods, 2013, 10(10): 973–976.

[29] Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015, 517(7536): 583–588.

[30] Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell, 2015, 160(1/2): 339–350.

[31] Fu YF, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 822–826.

[32] Cradick TJ, Fine EJ, Antico CJ, et al. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin andgenes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res, 2013, 41(20): 9584–9592.

[33] Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 827–832.

[34] Mali P, Aach J, Stranges PB, et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 833–838.

[35] Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 839–843.

[36] Ran FA, Hsu PD, Lin CY, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 2013, 154(6): 1380–1389.

[37] Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, et al. Dimeric CRISPR RNA-guidedⅠ nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol, 2014, 32(6): 569–576.

[38] Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 toⅠ nuclease improves the specificity of genome modification. Nat Biotechnol, 2014, 32(6): 577–582.

[39] Fu YF, Sander JD, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol, 2014, 32(3): 279–284.

[40] Bolukbasi MF, Gupta A, Oikemus S, et al. DNA-binding-domain fusions enhance the targeting range and precision of Cas9. Nat Methods, 2015, 12(12): 1150–1156.

[41] Davis KM, Pattanayak V, Thompson DB, et al. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nat Chem Biol, 2015, 11(5): 316–318.

[42] Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 2016, 529(7587): 490–495.

[43] Slaymaker IM, Gao LY, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, 2016, 351(6268): 84–88.

[44] Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163(3): 759–771.

[45] Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, et al. Structure and engineering ofCas9. Cell, 2016, 164(5): 950–961.

[46] Wolt JD, Wang K, Sashital D, et al. Achieving plant CRISPR targeting that limits off-target effects. Plant Genome, 2016, 9(3), doi: 10.3835/ plantgenome2016.05.0047.

[47] Xie KB, Zhang JW, Yang YN. Genome-wide prediction of highly specific guide RNA spacers for CRISPR-Cas9-mediated genome editing in model plants and major crops. Mol Plant, 2014, 7(5): 923–926.

[48] Heigwer F, Kerr G, Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods, 2014, 11(2): 122–123.

[49] Lei Y, Lu L, Liu HY, et al. CRISPR-P: a web tool for synthetic single-guide RNA design of CRISPR-system in plants. Mol Plant, 2014, 7(9): 1494–1496.

[50] Ma XL, Zhang QY, Zhu QL, et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol Plant, 2015, 8(8): 1274–1284.

[51] Lowder LG, Zhang DW, Baltes NJ, et al. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation. Plant Physiol, 2015, 169(2): 971–985.

[52] Nissim L, Perli SD, Fridkin A, et al. Multiplexed and programmable regulation of gene networks with an integrated RNA and CRISPR/Cas toolkit in human cells. Mol Cell, 2014, 54(4): 698–710.

[53] Xie KB, Minkenberg B, Yang YN. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(11): 3570–3575.

[54] Liang Y, Richardson S, Yan JW, et al. Endoribonuclease-based two-component repressor systems for tight gene expression control in plants. ACS Synth Biol, 2017, 6(5): 806-816.

[55] Gao YB, Zhao YD. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAsandfor CRISPR-mediated genome editing. J Integr Plant Biol, 2014, 56(4): 343–349.

[56] Leenay RT, Maksimchuk KR, Slotkowski RA, et al. Identifying and visualizing functional PAM diversity across CRISPR-cas systems. Mol Cell, 2016, 62(1): 137–147.

[57] Leenay RT, Beisel CL. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. J Mol Biol, 2017, 429(2): 177–191.

[58] Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature, 2015, 523(7561): 481–485.

[59] Hu XX, Wang C, Fu YP, et al. Expanding the range of CRISPR/Cas9 genome editing in rice. Mol Plant, 2016, 9(6): 943–945.

[60] Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420–424.

[61] Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353(6305): aaf8729.

[62] Hess GT, Frésard L, Han K, et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nat Methods, 2016, 13(12): 1036–1042.

[63] Ma YQ, Zhang JY, Yin WJ, et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat Methods, 2016, 13(12): 1029–1035.

[64] Kim D, Lim K, Kim ST, et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 475–480.

[65] Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 441–443.

[66] Zong Y, Wang YP, Li C, et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 438–440.

[67] Lu YM, Zhu JK. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(3): 523–525.

[68] Li JY, Sun YW, Du JL, et al. Generation of targeted point mutations in rice by a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(3): 526–529.

[69] Kim D, Kim J, Hur JK, et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2016, 34(8): 863–868.

[70] Fonfara I, Richter H, Bratovi? M, et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature, 2016, 532(7600): 517–521.

[71] Zetsche B, Heidenreich M, Mohanraju P, et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol, 2017, 35(1): 31–34.

[72] Xu RF, Qin RY, Li H, et al. Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1 system. Plant Biotechnol J, 2017, 15(6): 713–717.

[73] Tang X, Lowder LG, Zhang T, et al. A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat Plants, 2017, 3: 17018.

[74] Yin XJ, Biswal AK, Dionora J, et al. CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 mediated targeting of a stomatal developmental genein rice. Plant Cell Reports, 2017, 36(5): 745–757, doi: 10.1007/s00299-017-2118-z.

[75] Tóth E, Weinhardt N, Bencsura P, et al. Cpf1 nucleases demonstrate robust activity to induce DNA modification by exploiting homology directed repair pathways in mammalian cells. Biol Direct, 2016, 11: 46.

[76] Hu XX, Wang C, Liu Q, et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cpf1 system. J Genet Genomics, 2017, 44(1): 71–73.

[77] Ungerer J, Pakrasi HB. Cpf1 is a versatile tool for CRISPR genome editing across diverse species of cyanobacteria. Sci Rep, 2016, 6: 39681.

[78] Endo A, Masafumi M, Kaya H, et al. Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes using Cpf1 from. Sci Rep, 2016, 6: 38169.

[79] Wang MG, Mao YF, Lu YM, et al. Multiplex gene editing in rice using the CRISPR-Cpf1 system. Mol Plant, 2017, doi: 10.1016/j.molp.2017.03.001.

[80] Wolt JD, Wang K, Yang B. The regulatory status of genome-edited crops. Plant Biotechnol J, 2016, 14(2): 510–518.

[81] Wang YP, Cheng X, Shan QW, et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol, 2014, 32(9): 947–951.

[82] Zhou H, He M, Li J, et al. Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediatedediting system. Sci Rep, 2016, 6: 37395.

[83] Ji X, Zhang H, Zhang Y, et al. Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants. Nat Plants, 2015, 1: 15144.

[84] Baltes NJ, Hummel AW, Konecna E, et al. Conferring resistance to geminiviruses with the CRISPR-Cas prokaryotic immune system. Nat Plants, 2015, 1(10): 15145.

[85] Ali Z, Abulfaraj A, Idris A, et al. CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants. Genome Biol, 2015, 16: 238.

[86] Woo JW, Kim J, Kwon SI, et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nat Biotechnol, 2015, 33(11): 1162–1164.

[87] Svitashev S, Schwartz C, Lenderts B, et al. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nat Commun, 2016, 7: 13274.

[88] Malnoy M, Viola R, Jung MH, et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Front Plant Sci, 2016, 7: 1904.

[89] Kim H, Kim ST, Ryu J, et al. CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing. Nat Commun, 2017, 8: 14406.

[90] Zhang Y, Liang Z, Zong Y, et al. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA. Nat Commun, 2016, 7: 12617.

[91] Waltz E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation. Nature, 2016, 532(7599): 293.

(本文責編 陳宏宇)

Recent progresses in CRISPR genome editing in plants

Hong Li, and Kabin Xie

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

In the past 4 years, CRISPR/Cas9-mediated genome editing becomes the revolutionary tool in life sciences. This tool enables us to edit plant genes with unprecedented throughput, scalability, speed and low cost. In addition to targeted knock-in and knock-out applications, CRISPR/Cas9 also provides an efficient platform for targeted gene activation and suppression. At the same time, accuracy, capacity and efficiency of CRISPR/Cas9 genome editing have been improved for sophisticated genetic manipulation. Furthermore, the genome editing toolbox is expanded by new technologies like CRISPR/Cpf1-mediated genome editing and single base editing. Owing to these recent progresses, CRISPR technology is close to the dream tool for plant sciences and will accelerate the crop genetic improvement through precise genome editing.

CRISPR/Cas9, crop, gene targeting, genetic improvement, progress

April 24, 2017;

June 12, 2017

Kabin Xie. E-mail: kabinxie@mail.hzau.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos.31571374, 31622047).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31571374, 31622047) 資助。

2017-06-26

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20170626.1454.004.html

謝卡斌 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授，2016年獲國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金。主要研究領(lǐng)域為水稻與病原微生物互作的分子機制、CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的開發(fā)及其在作物中的應(yīng)用。迄今在、、、等期刊發(fā)表SCI收錄論文20余篇。申請專利3項，已獲批1項。