劉真，蔡毅君，孫強(qiáng)

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非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型研究進(jìn)展

劉真，蔡毅君，孫強(qiáng)

中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院靈長(zhǎng)類(lèi)神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200031

劉真, 蔡毅君, 孫強(qiáng). 非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(10): 1665–1673.Liu Z, Cai YJ, Sun Q. Advance of gene-modified non-human primate models. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1665–1673.

非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域具有非常重要的地位。近年來(lái)隨著慢病毒載體轉(zhuǎn)染及靶向核酸酶 (ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9) 等基因操作技術(shù)的出現(xiàn)，科學(xué)家們成功地獲得了外源基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因猴和目的基因定點(diǎn)切割的基因編輯猴。文中對(duì)目前利用慢病毒載體獲得轉(zhuǎn)基因猴和利用靶向核酸酶獲得基因編輯猴的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并討論了基因修飾猴的嵌合體現(xiàn)象、脫靶現(xiàn)象及非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物較長(zhǎng)性成熟時(shí)間這幾個(gè)影響非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型推廣應(yīng)用的因素，最后展望了非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型構(gòu)建技術(shù)的研究熱點(diǎn)及發(fā)展趨勢(shì)。

非人靈長(zhǎng)類(lèi)，基因修飾，慢病毒載體，靶向核酸酶

基因修飾動(dòng)物模型在生命科學(xué)研究中發(fā)揮著極其重要的作用。其中大小鼠是哺乳類(lèi)中最常用的模式動(dòng)物，也是基因修飾手段應(yīng)用最成熟的物種。利用慢病毒載體、轉(zhuǎn)座子、胚胎干細(xì)胞以及靶向核酸酶等基因操作手段，科學(xué)家們可以構(gòu)建各種攜帶轉(zhuǎn)基因、基因敲除和基因敲入等基因修飾的大小鼠動(dòng)物模型。這些動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用到免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、心血管疾病等各個(gè)領(lǐng)域，為人們理解生命現(xiàn)象的本質(zhì)作出了巨大的貢獻(xiàn)。盡管如此，利用大小鼠作為動(dòng)物模型仍然有很多局限性，尤其是在神經(jīng)科學(xué)認(rèn)知研究領(lǐng)域，大小鼠很難有類(lèi)似人的高級(jí)認(rèn)知功能。另外絕大多數(shù)利用模擬人類(lèi)腦疾病的大小鼠模型開(kāi)發(fā)的藥物也都以失敗告終。

非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，指除人以外的所有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，作為最接近于人的模式動(dòng)物，其在基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域有重要的地位[1]。相比于大小鼠等嚙齒類(lèi)哺乳動(dòng)物，非人靈長(zhǎng)類(lèi)與人類(lèi)有著更多相似的生物學(xué)特征，被認(rèn)為是研究高等認(rèn)知以及腦疾病的最理想的模式動(dòng)物。因此，國(guó)際科學(xué)界很早就對(duì)非人靈長(zhǎng)類(lèi)高度重視，并建立了很多非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心。目前非人靈長(zhǎng)類(lèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要包括隸屬于舊大陸猴分支獼猴屬的食蟹猴和恒河猴及新大陸猴分支的絨猴。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)可以成功地對(duì)非人靈長(zhǎng)類(lèi)的基因組進(jìn)行基因修飾，獲得外源基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因猴和目的基因定點(diǎn)切割的基因編輯猴。我們國(guó)家的非人靈長(zhǎng)類(lèi)資源非常豐富，全國(guó)各地有多個(gè)非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖基地。國(guó)家對(duì)利用非人靈長(zhǎng)類(lèi)開(kāi)展科學(xué)研究也非常重視，即將開(kāi)始的中國(guó)腦計(jì)劃中，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物將會(huì)發(fā)揮非常重要的作用。

慢病毒載體感染和分子靶向核酸酶(ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9等) 是非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型構(gòu)建中最常用的兩種方法。利用這兩種方法獲得的首建動(dòng)物 (F0) 有可能是嵌合體，這導(dǎo)致科學(xué)家們很難在F0代得到基因型和表型一致的動(dòng)物模型。傳代到F1可以有效解決嵌合體問(wèn)題，但常用的恒河猴和食蟹猴正常性成熟時(shí)間至少需要4年，加上半年的懷孕期，即至少需要4.5年才能得到F1代。這嚴(yán)重限制了基因修飾恒河猴和食蟹猴模型的推廣和應(yīng)用。

本文中，我們將對(duì)基因修飾非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型的構(gòu)建進(jìn)行綜述，并對(duì)限制非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型推廣應(yīng)用的因素展開(kāi)討論，最后對(duì)非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型構(gòu)建技術(shù)的研究熱點(diǎn)及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 慢病毒載體介導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展

在生殖生理特性方面，食蟹猴和恒河猴都是有月經(jīng)單胎繁殖動(dòng)物，即每個(gè)經(jīng)期排卵1?2枚。由于存在優(yōu)勢(shì)卵泡效應(yīng)，即使是用激素對(duì)其進(jìn)行超數(shù)排卵 (超排) 處理，自然受孕一般也只有1?2枚卵母細(xì)胞排出并受精。因此，用于大小鼠通過(guò)直接取受精卵后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的方法在非人靈長(zhǎng)類(lèi)上并不適用。同時(shí)，由于既沒(méi)有足夠的卵巢用于收集成熟前卵母細(xì)胞，也沒(méi)有建立一種可靠的卵母細(xì)胞體外成熟體系，諸如在牛和豬等動(dòng)物上通過(guò)體外成熟獲得卵母細(xì)胞資源的方法在非人靈長(zhǎng)類(lèi)上也不可行。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型構(gòu)建中，要得到更多卵母細(xì)胞用于胚胎構(gòu)建，需通過(guò)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行超排處理使卵巢中多數(shù)卵泡生長(zhǎng)，并在自發(fā)排卵前將更多發(fā)育的卵泡內(nèi)成熟卵母細(xì)胞取出來(lái)實(shí)現(xiàn)。但即便如此，卵母細(xì)胞和胚胎資源還是有限，因此，為充分利用有限的胚胎資源，必須建立高效的轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)。

2001年，Chan等利用高滴度的慢病毒轉(zhuǎn)染早期恒河猴卵母細(xì)胞后再進(jìn)行單精子注射和胚胎移植，成功得到了轉(zhuǎn)GFP的恒河猴ANDi[2]。雖然在其得到的3只出生個(gè)體中僅有1只檢測(cè)到了外源基因GFP的整合和嵌合表達(dá)，但這一開(kāi)創(chuàng)性的工作標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因非人靈長(zhǎng)類(lèi)技術(shù)的誕生。同年7月，Wolfgang等同樣利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染恒河猴囊胚期胚胎后移植，也得到了在胎盤(pán)組織中整合了外源eGFP的轉(zhuǎn)基因恒河猴[3]。這兩個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的工作說(shuō)明轉(zhuǎn)基因非人靈長(zhǎng)類(lèi)技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從理想到現(xiàn)實(shí)的轉(zhuǎn)變。但他們都選擇綠色熒光蛋白作為轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因，其主要目的還是用來(lái)探討轉(zhuǎn)基因非人靈長(zhǎng)類(lèi)技術(shù)的可行性。隨著研究的深入和技術(shù)的成熟，科學(xué)家們開(kāi)始把目標(biāo)轉(zhuǎn)向了功能基因。2008年該技術(shù)才終于在非人靈長(zhǎng)類(lèi)模式動(dòng)物構(gòu)建上得以成功應(yīng)用，Yang等利用該技術(shù)將亨廷頓舞蹈癥的致病基因成功導(dǎo)入到恒河猴體內(nèi)，并得到了具有類(lèi)似亨廷頓舞蹈癥表型的動(dòng)物模型[4]。亨廷頓疾病是一種顯性的神經(jīng)性病變疾病，主要是因?yàn)槿撕嗤㈩D基因(HTT) 第一個(gè)外顯子中CAG重復(fù)擴(kuò)增，導(dǎo)致表達(dá)的亨廷頓蛋白中含有多聚谷氨酰胺，從而引發(fā)運(yùn)動(dòng)機(jī)能損傷、認(rèn)知功能退化和精神失調(diào)等一系列病癥，患者發(fā)病10?15年后就會(huì)死亡。雖然嚙齒類(lèi)也有亨廷頓疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，但這些模型都不能很好地模擬亨廷頓疾病在人體的表型特征。在亨廷頓轉(zhuǎn)基因恒河猴的工作中，作者把人HTT基因的第一個(gè)外顯子上后面鏈接84個(gè)CAG重復(fù)序列，并把這段重組序列包裝到慢病毒載體中，得到高滴度的慢病毒顆粒(滴度>109PFU/mL)。通過(guò)卵母細(xì)胞透明帶下注射把病毒粒子注射到恒河猴MⅡ期卵母細(xì)胞的卵周隙。之后，再通過(guò)單精注射讓卵母細(xì)胞受精和胚胎移植，成功得到轉(zhuǎn)基因恒河猴。分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因猴不僅表達(dá)了外源基因，而且出現(xiàn)了神經(jīng)纖維網(wǎng)聚集、核內(nèi)含物，同時(shí)，表現(xiàn)出肌無(wú)力和舞蹈癥等亨廷頓舞蹈癥病人的典型標(biāo)志表型。作為第一個(gè)非人靈長(zhǎng)類(lèi)疾病動(dòng)物模型，亨廷頓疾病轉(zhuǎn)基因恒河猴模型的意義之大是不言而喻的。該模型可以讓人們更好、更深入地了解亨廷頓疾病，研究其發(fā)病機(jī)制和致病機(jī)理，從而研發(fā)出相對(duì)應(yīng)的治療方案和藥物。同時(shí)，該模型的建立也證明了構(gòu)建其他非人靈長(zhǎng)類(lèi)疾病模型的可行性。其后，2009年日本科學(xué)家Sasaki等利用絨猴性成熟時(shí)間相對(duì)較短的特性，通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功得到了可生殖系傳遞的GFP轉(zhuǎn)基因絨猴[5]。我國(guó)雖然在非人靈長(zhǎng)類(lèi)輔助生殖和轉(zhuǎn)基因技術(shù)上起步較晚，但是經(jīng)過(guò)近10年的發(fā)展已經(jīng)逐漸趕上并超過(guò)了美國(guó)、日本等國(guó)，處于世界領(lǐng)先地位。2008年華東師范大學(xué)報(bào)道了國(guó)內(nèi)首例試管食蟹猴[6]；2010年中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所報(bào)道了國(guó)內(nèi)首例轉(zhuǎn)基因猴[7]；2011年中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所利用該技術(shù)將人的自閉癥相關(guān)致病基因MeCP2成功轉(zhuǎn)入食蟹猴個(gè)體，得到了多只MeCP2轉(zhuǎn)基因食蟹猴首建猴，并利用精巢移植技術(shù)提早得到了F1代轉(zhuǎn)基因猴，經(jīng)過(guò)全面系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)這些MeCP2轉(zhuǎn)基因食蟹猴有類(lèi)似人類(lèi)自閉癥表型[8]。

2 靶向核酸酶介導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因編輯研究進(jìn)展

通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)得到的非人靈長(zhǎng)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)只能完成外源基因的過(guò)表達(dá)操作，致其應(yīng)用范圍有限。由于在非人靈長(zhǎng)類(lèi)上還未建立可生殖系整合的猴胚胎干細(xì)胞系，因此還不能像通過(guò)胚胎干細(xì)胞基因打靶操作獲得基因敲除小鼠模型那樣來(lái)構(gòu)建基因敲除猴模型。近年來(lái)，隨著鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 和RNA介導(dǎo)的基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列和Cas9蛋白的DNA核酸內(nèi)切酶 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas9) 這3種靶向核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)及其在模式動(dòng)物構(gòu)建上的應(yīng)用[9-16]，使得我們可以跨過(guò)非人靈長(zhǎng)類(lèi)無(wú)胚胎干細(xì)胞用于進(jìn)行同源重組基因打靶的這一技術(shù)障礙，直接通過(guò)早期猴胚胎期注射用于靶向特定基因的ZFN、TALEN或Cas9/sgRNA對(duì)靶基因進(jìn)行編輯，進(jìn)而獲得相應(yīng)靶基因突變的猴模型。2014年，來(lái)自昆明理工大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)分別通過(guò)受精卵注射靶向食蟹猴Mecp2基因的TALEN質(zhì)粒和mRNA得到了Mecp2基因突變食蟹猴[17-18]。Mecp2是一個(gè)位于X染色體上的純合突變致死基因，該基因突變的病人會(huì)發(fā)生瑞特氏綜合征。隨后南京大學(xué)、南京醫(yī)科大學(xué)和昆明理工大學(xué)聯(lián)合報(bào)道了使用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了基因編輯的食蟹猴。該工作通過(guò)將針對(duì)Ppar-γ、Rag1和Nr0b1三個(gè)基因的5條sgRNA和Cas9 mRNA混合注入食蟹猴受精卵的卵胞質(zhì)并將注射后的胚胎移植到代孕受體，最后得到了兩只Ppar-γ和Rag1基因編輯的個(gè)體[19]。之后，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所的團(tuán)隊(duì)報(bào)道了利用CRIPSR-Cas9技術(shù)獲得了p53基因雙等位基因突變的食蟹猴[20]。2015年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和昆明理工大學(xué)聯(lián)合報(bào)道了DMD基因編輯恒河猴[21]。2016年，日本科學(xué)家利用ZFN和TALEN成功獲得了IL2RG基因編輯絨猴[22]。至此，過(guò)表達(dá)和基因編輯這兩項(xiàng)主要的模式動(dòng)物構(gòu)建技術(shù)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)的主要物種恒河猴、食蟹猴和絨猴上都獲得了成功。

3 限制非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型推廣應(yīng)用的因素

無(wú)論是利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染獲得的轉(zhuǎn)基因猴還是利用靶向核酸酶獲得的基因編輯猴，其首建猴多數(shù)都以嵌合體的形式存在。對(duì)于存活的嵌合體首建猴，我們很難精確地將轉(zhuǎn)基因或目的基因突變和潛在表型對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，利用這些方法得到的嵌合體首建猴，并不能稱(chēng)之為標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型。

在利用慢病毒載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因猴時(shí)，不同數(shù)目的慢病毒載體基因組可以在早期胚胎多個(gè)時(shí)間點(diǎn)整合到猴基因組，其整合數(shù)目和整合時(shí)間呈一定的隨機(jī)性。這就導(dǎo)致注射同一批病毒載體的不同胚胎發(fā)育得到的個(gè)體的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)差別有可能很大，而且同一只轉(zhuǎn)基因個(gè)體其體內(nèi)不同細(xì)胞所含有的轉(zhuǎn)基因數(shù)目和整合位點(diǎn)也有可能不同。那么利用相同的慢病毒獲得的同批轉(zhuǎn)基因首建猴就可能會(huì)出現(xiàn)表型的差異。在我們利用慢病毒構(gòu)建Mecp2轉(zhuǎn)基因食蟹猴的工作中，對(duì)獲得的10只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性首建猴的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因猴中，最少含有1個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，而最多則含有7個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。我們利用其中1只含有6個(gè)Mecp2轉(zhuǎn)基因數(shù)的雄性首建猴進(jìn)行傳代，獲得了5只Mecp2轉(zhuǎn)基因F1代食蟹猴。分析發(fā)現(xiàn)這5只F1代的Mecp2轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)從2–6不等[8,23]。這既可能是由于F1代的基因分離所導(dǎo)致的，也可能是由于Mecp2轉(zhuǎn)基因首建猴生殖細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因嵌合體所導(dǎo)致的。雖然每只F1代轉(zhuǎn)基因食蟹猴體內(nèi)含有不同的Mecp2拷貝數(shù)，但是可以肯定的是每只F1代的個(gè)體內(nèi)不同組織和細(xì)胞含有的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)目及整合位點(diǎn)是一致的，即F1代轉(zhuǎn)基因食蟹猴不是以嵌合體存在。利用F1代轉(zhuǎn)基因猴作為動(dòng)物模型獲得的結(jié)果會(huì)更具有說(shuō)服力。

在利用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等靶向核酸酶來(lái)進(jìn)行基因編輯猴構(gòu)建時(shí)，獲得的首建猴基本上也都以嵌合體形式存在[24]。這是因?yàn)榘邢蚝怂崦冈趯?duì)目的打靶序列實(shí)現(xiàn)雙鏈切割后，切割斷裂后的DNA多數(shù)會(huì)以非同源末端連接來(lái)進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)后的目的打靶序列會(huì)出現(xiàn)各種形式的基因突變，從而可能導(dǎo)致該基因功能的失活。注射針對(duì)同一打靶位點(diǎn)的靶向核酸酶，獲得的同一批首建猴很可能含有不同的目的基因突變序列，同一只首建猴體內(nèi)的不同組織細(xì)胞內(nèi)也會(huì)有不同形式的目的基因突變序列。另外不同基因編輯首建猴體內(nèi)也往往會(huì)含有不同比例的野生型序列。在我們利用TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的多個(gè)基因編輯首建猴模型中，我們發(fā)現(xiàn)基本所有的首建猴都是以嵌合體形式存在，即使有的首建猴體內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到野生型序列，該首建猴也包含有不同形式的突變型序列。嵌合現(xiàn)象的存在使我們很難判斷該靶基因在不同細(xì)胞組織中是否真正失活，所以從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角度來(lái)說(shuō)，獲得的首建猴我們只能稱(chēng)之為基因編輯猴，而不能稱(chēng)之為基因敲除猴。由于每個(gè)生殖細(xì)胞只能獲得一種突變型，通過(guò)F0代基因編輯首建猴與野生型猴交配得到的子代猴 (F1代) 將不會(huì)再有嵌合現(xiàn)象，如果F1代中含有使該基因失活的基因突變，那么我們可以稱(chēng)此F1代為雜合的基因敲除猴。因此通過(guò)F0代基因編輯首建猴直接互配，就有機(jī)會(huì)獲得真正的 (F1代) 基因敲除猴?？紤]到非人靈長(zhǎng)類(lèi)較長(zhǎng)的性成熟時(shí)間及靶向核酸酶技術(shù)應(yīng)用于非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因編輯模型構(gòu)建才3年左右的時(shí)間，目前未見(jiàn)真正的F1代基因敲除猴報(bào)道。

利用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等靶向核酸酶來(lái)進(jìn)行基因編輯猴構(gòu)建存在的另外一個(gè)問(wèn)題就是脫靶現(xiàn)象[24]。在使用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因編輯動(dòng)物模型時(shí)，脫靶現(xiàn)象尤為突出。前文中提到的已經(jīng)報(bào)道的多個(gè)基因編輯猴都沒(méi)有檢測(cè)到脫靶現(xiàn)象的存在，但由于檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)目的限制，很難說(shuō)這些首建基因編輯猴就沒(méi)有脫靶突變發(fā)生。在我們通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的多批基因編輯首建猴中都檢測(cè)到了脫靶突變。因此，脫靶現(xiàn)象的存在也是潛在的限制基因編輯首建猴作為動(dòng)物模型開(kāi)展深入研究不可回避的因素之一。

無(wú)論是首建猴的嵌合體現(xiàn)象還是脫靶現(xiàn)象，傳代至F1代是將不同轉(zhuǎn)基因或基因突變及脫靶突變分離進(jìn)而獲得真正的轉(zhuǎn)基因或基因敲除動(dòng)物模型的一個(gè)有效策略，但這還有一個(gè)性成熟時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題無(wú)法回避。常用的恒河猴和食蟹猴其性成熟約需要4?5年的時(shí)間[25-27]。我們也針對(duì)蘇州猴群的公猴進(jìn)行了精液采集和精子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)至少要50月齡以上的公猴精液中才會(huì)出現(xiàn)精子。針對(duì)這一障礙，我們開(kāi)發(fā)了食蟹猴的精巢異種移植技術(shù)來(lái)加速其精子生成。通過(guò)將青少年食蟹猴精巢組織塊移植到去勢(shì)成年雄性裸鼠的背部，成功將食蟹猴的精子發(fā)生時(shí)間縮短到了24個(gè)月，并利用獲得的精子進(jìn)行胚胎構(gòu)建和移植得到了健康的食蟹猴后代[23]。這將推動(dòng)非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型在基礎(chǔ)研究及生物醫(yī)藥研究中的應(yīng)用。

4 非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型構(gòu)建技術(shù)研究熱點(diǎn)及展望

基因編輯首建猴的嵌合體現(xiàn)象是影響其作為動(dòng)物模型用于科學(xué)研究的一大障礙，除了傳代至F1代以外，通過(guò)改進(jìn)方法一步獲得無(wú)野生序列嵌合現(xiàn)象的基因編輯首建猴，將提高利用基因編輯首建猴作為科學(xué)研究的可能性。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯猴構(gòu)建時(shí)，其基因組內(nèi)不同位點(diǎn)對(duì)于切割效率的影響非常大，有些位點(diǎn)可以利用CRISPR/Cas9對(duì)其實(shí)現(xiàn)高效切割，有些位點(diǎn)則很難被切割。所以首先篩選高效的sgRNA打靶位點(diǎn)，是利用CRISPR/Cas9獲得基因編輯猴的重要因素。另外我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)將多條sgRNA混合注射的方法，也可以明顯提高獲得無(wú)野生型序列嵌合的基因編輯首建猴。

另外針對(duì)脫靶，通過(guò)分析篩選脫靶效應(yīng)低的sgRNA進(jìn)行首建猴構(gòu)建，或利用兩條sgRNA及Cas9 nickase來(lái)對(duì)目的打靶位點(diǎn)的兩條DNA鏈分別切割，可以潛在大大降低脫靶效應(yīng)[28]。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)上是否可以得到同樣效果，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

無(wú)論是脫靶現(xiàn)象還是嵌合體現(xiàn)象，都可以通過(guò)傳代來(lái)對(duì)不同基因型和脫靶突變進(jìn)行分離。由于非人靈長(zhǎng)類(lèi)性成熟周期非常漫長(zhǎng)，那么研究縮短非人靈長(zhǎng)類(lèi)性成熟周期的方法進(jìn)而實(shí)現(xiàn)繁殖加速將會(huì)推動(dòng)非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究應(yīng)用。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了食蟹猴的精巢異種移植來(lái)實(shí)現(xiàn)其繁殖加速，但是該方法技術(shù)復(fù)雜而且效率較低[23]。那么開(kāi)發(fā)其他非人靈長(zhǎng)類(lèi)繁殖加速的方法也會(huì)是未來(lái)非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型的一個(gè)重要的研究方向。

盡管科學(xué)家們已經(jīng)可以利用靶向核酸酶對(duì)非人靈長(zhǎng)類(lèi)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)切割，獲得目的基因突變的基因編輯猴，然而目前還沒(méi)有成功利用靶向核酸酶和外源同源片段通過(guò)同源重組來(lái)獲得基因敲入猴[29]的報(bào)道。傳統(tǒng)的方法是利用CRISPR/Cas9對(duì)目的序列插入位點(diǎn)進(jìn)行切割及同源臂介導(dǎo)的同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)外源片段的插入，但是該方法總體效率偏低。目前在細(xì)胞和大小鼠水平，已經(jīng)有多篇文章報(bào)道可以提升利用CRISPR/Cas9等靶向核酸酶介導(dǎo)的基因敲入。例如通過(guò)加入小分子抑制NHEJ (非同源末端連接) 的發(fā)生，可以提高CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞或小鼠胚胎水平基因敲入的效率[30-31]；也有報(bào)道稱(chēng)將細(xì)胞同步化在特定細(xì)胞周期也可以提高CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞水平的基因敲入[32]；通過(guò)TALEN及CRISPR/Cas9和短的同源臂介導(dǎo)的末端連接也能在細(xì)胞和胚胎水平提高外源片段精確敲入的效率[33]。值得一提的是，我們實(shí)驗(yàn)室與本所楊輝課題組合作的課題中，通過(guò)利用CRISPR/Cas9及800 bp同源臂介導(dǎo)的末端連接實(shí)現(xiàn)了高效的小鼠和食蟹猴胚胎水平的基因敲入[34]。盡管有多種方法提升基因敲入的效率，但是總體來(lái)說(shuō)仍不理想，且獲得的首建動(dòng)物很有可能以嵌合體形式存在，可以判斷即使利用此方法獲得了陽(yáng)性基因敲入猴，其距離作為真正的動(dòng)物模型用于科學(xué)研究仍有較長(zhǎng)的路要走。

在猴的精確基因敲入實(shí)現(xiàn)之前，想要在特定細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)表達(dá)標(biāo)記蛋白或功能蛋白 (如光敏感通道蛋白等)，利用腺相關(guān)病毒進(jìn)行成體動(dòng)物注射是一個(gè)折中的選擇。2016年劍橋大學(xué)Stauffer等首次報(bào)道利用包含特異啟動(dòng)子THp啟動(dòng)的Cre和包含Cre依賴(lài)的ChR2兩種腺相關(guān)病毒混合注入恒河猴中腦，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)外部光源特異性激活恒河猴中腦多巴胺能神經(jīng)元的目的[35]。

在小鼠基因修飾模型構(gòu)建中，除了慢病毒載體和靶向核酸酶以外，利用胚胎干細(xì)胞囊胚注射、體細(xì)胞核移植、單倍體干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因等技術(shù)雖然不如以CRISPR/Cas9為代表的靶向核酸酶簡(jiǎn)單易行，但是這些方法都有各自的優(yōu)勢(shì)并且在小鼠水平都取得了成功[36-38]。而且利用以上方法可以獲得攜帶復(fù)雜基因修飾的基因敲入首建動(dòng)物模型。體細(xì)胞核移植、單倍體干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因獲得的首建動(dòng)物更是沒(méi)有嵌合體現(xiàn)象存在。但是目前這些方法在非人靈長(zhǎng)類(lèi)都還沒(méi)有獲得成功?？紤]到非人靈長(zhǎng)類(lèi)自身特點(diǎn)，此類(lèi)方法在非人靈長(zhǎng)類(lèi)的應(yīng)用研究也是非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾模型構(gòu)建技術(shù)的一個(gè)重要的方向[39]。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Advance of gene-modified non-human primate models

Zhen Liu, Yijun Cai, and Qiang Sun

State Key Laboratory of Neuroscience, Key Laboratory of Primate Neurobiology, CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology, Institute of Neuroscience, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China

Non-human primates would be particularly valuable in life sciences and biomedical research area. Gene-modified monkeys with gene overexpression or loss of function have been successfully generated with the rapid advance in gene manipulation technology such as lentivirus infection and programmable nucleases (ZFN, TALEN, CRISPR-Cas9). Here we review the recent development on gene-modified monkey generation by lentivirus and programmable nucleases. Then we discuss three concerns, the long time for sexual maturation, the off target and the mosaicism of founders, which limit the wide application of gene-modified non-human-primates. At last, hotspots and future trend for gene-modified non-human-primates generation are proposed.

non-human primate, gene-modified, lentivirus, programmable nucleases

May 5, 2017;

June 28, 2017

Qiang Sun. Tel: +86-21-54921757; E-mail: qsun@ion.ac.cn

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No. 2014BAI03B00) 資助。

2017-08-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170804.1028.001.html

Supported by: Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2014BAI03B00).

孫強(qiáng) 正高級(jí)工程師，中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長(zhǎng)類(lèi) (蘇州) 研究平臺(tái)主任，獲中國(guó)科學(xué)院關(guān)鍵技術(shù)“百人計(jì)劃”支持。孫強(qiáng)博士致力于非人靈長(zhǎng)類(lèi)基因修飾動(dòng)物模型的構(gòu)建及技術(shù)研發(fā)。他領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)建立了高效的非人靈長(zhǎng)類(lèi)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)平臺(tái)；并且開(kāi)發(fā)了食蟹猴精巢異種移植技術(shù)，大大縮短了食蟹猴的性成熟周期。作為通訊作者或第一作者在、、等著名學(xué)術(shù)期刊發(fā)表多篇研究論文。其作為通訊作者在發(fā)表的具有自閉癥表型的轉(zhuǎn)基因食蟹猴的工作被科技部評(píng)為“2016中國(guó)科學(xué)十大進(jìn)展”。