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(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500)

甜菜堿對單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1油脂積累的影響

李大菲,趙永騰,趙鵬,徐軍偉,李濤,余旭亞*

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500)

為提高單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1的生物量和油脂產(chǎn)量,本文結(jié)合兩階段策略,即異養(yǎng)-光誘導(dǎo)培養(yǎng)方法,研究甜菜堿(GB)對單針藻QLY-1生長和油脂積累的影響。結(jié)果表明,異養(yǎng)、自養(yǎng)的微藻生物量分別為(5.54±0.22)、(0.878±0.12)g/L,且異養(yǎng)比自養(yǎng)提高了5.3倍。此外,在光脅迫下,添加5 mmol/L甜菜堿時可有效提高微藻的油脂含量,其油脂含量(47.37%±2.93%)相比對照(36.68%±1.34%)提高了0.29倍(p<0.05)。進(jìn)一步的研究表明,與對照相比,添加5 mmol/L甜菜堿時,藻細(xì)胞中性脂增加了12.83%±0.75%,對藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成無顯著性影響。研究表明,甜菜堿作為一種外源誘導(dǎo)子可有效促進(jìn)微藻細(xì)胞中油脂積累,甜菜堿結(jié)合兩階段法可作為促進(jìn)微藻細(xì)胞油脂積累的另一策略。

Monoraphidiumsp.QLY-1,油脂產(chǎn)率,油脂含量,甜菜堿,兩階段培養(yǎng)

化石能源不可再生,綠色能源的開發(fā)和利用受到越來越多的關(guān)注,生物柴油具有可再生等特點(diǎn),可作為理想的化石能源替代品[1]。微藻具有產(chǎn)油量高、生物產(chǎn)量高、生長速率快、占耕地面積小、光合作用效率高、生物燃料污染小、溫室氣體排放少等特點(diǎn),微藻的優(yōu)勢使其成為生產(chǎn)生物柴油的良好原料[2-7]。

一直以來,增加微藻的油脂產(chǎn)率、降低其油脂培養(yǎng)成本是微藻生物柴油制備領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。改變其培養(yǎng)方式、選擇合適的誘導(dǎo)條件是增加油脂產(chǎn)率的有效途徑。傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)方法多數(shù)為單一的外界脅迫條件,例如營養(yǎng)缺陷、高鹽或強(qiáng)光照下促進(jìn)微藻細(xì)胞中油脂積累[8]。一些新的策略如添加植物激素或化學(xué)誘導(dǎo)子并結(jié)合脅迫條件來解決傳統(tǒng)培養(yǎng)方式導(dǎo)致的生物量和油脂產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、單一的營養(yǎng)限制等問題,從而盡可能的提高微藻細(xì)胞中油脂含量,成為近年來研究的熱點(diǎn)[9-10]。兩階段培養(yǎng)法是一種有效提高微藻生長和油脂積累的方法[11]。第一階段異養(yǎng)提高生物量,第二階段自養(yǎng)提高脂含量;從而使微藻的生物量和油脂產(chǎn)量最大化。研究表明,利用兩階段培養(yǎng)微藻可提高生物量與脂含量[9,12]。

甜菜堿是一類成分復(fù)雜的水溶性天然有機(jī)溶質(zhì),是一種植物生長調(diào)節(jié)劑,是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),具有維持細(xì)胞滲透壓平衡的作用,對蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜有保護(hù)作用[13],可促進(jìn)植物的生長發(fā)育,是優(yōu)良的生物誘導(dǎo)劑[14-15]。油脂是微藻在脅迫條件下產(chǎn)生并積累的次生代謝產(chǎn)物,與黃腐酸類似,甜菜堿作為外源誘導(dǎo)子可能對微藻油脂的積累有一定的促進(jìn)作用[16];且甜菜堿對單針藻中油脂的積累影響和機(jī)理方面的研究還鮮有報道。

本實(shí)驗(yàn)以單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1為研究對象,在兩階段培養(yǎng)的基礎(chǔ)上研究添加不同濃度甜菜堿對單針藻生長和油脂合成的影響,并探究其對脂肪酸組成和油脂分級的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1 為本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存;甜菜堿 純度≥99%,昆明碩陽有限公司;甲醇、丙酮、氯仿 分析純,昆明鼎國試劑公司。

TS-2011GZ恒溫光照振蕩搖床 上海天呈;XS-212-202顯微鏡 JNOEC;VS-840-1超凈工作臺 上海博訊;FD5-12冷凍干燥機(jī)SIM International Group;Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計(jì) Amersham Biosciences;LDZX-50KBS滅菌鍋 上海申安;FA2004N分析天平 上海箐海;HHW-D6水浴鍋 金壇雙捷;5804R離心機(jī) Eppendorf;1730R高速冷凍離心機(jī) Labogene Scanspeed。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1的培養(yǎng) 接種至250 mL BG-11培養(yǎng)基中,25 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 微藻的培養(yǎng)條件 第一階段為異養(yǎng)培養(yǎng):BG-11培養(yǎng)基中添加10 g/L的葡萄糖,無光照、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,培養(yǎng)溫度25 ℃[17]。第二階段為自養(yǎng)培養(yǎng):將生長至對數(shù)期的種子液接種至自養(yǎng)培養(yǎng)基中;添加甜菜堿誘導(dǎo),將不同濃度梯度的甜菜堿添加至BG-11培養(yǎng)基中,使其形成濃度梯度,甜菜堿的濃度分別為5、10、20 mmol/L,對數(shù)期的種子液接種到不含甜菜堿的BG-11自養(yǎng)培養(yǎng)基作為對照,每組設(shè)3個平行樣;置于25 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,光照強(qiáng)度為3500 lux。在誘導(dǎo)第1、3、5 d分別收藻,并進(jìn)行微藻的離心富集和油脂提取。

1.3微藻的富集及油脂提取

采用隔天取樣的方式,將新鮮藻液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進(jìn)行離心富集(4500 r/min,5 min),將收集的藻體進(jìn)行冷凍干燥,制得的藻粉(w1)加入3 mL體積比為2∶1的氯仿甲醇溶液提取油脂(150 r/min,20 min),離心取上清(2000 r/min,10 min),重復(fù)提取至藻體發(fā)白(2～3次),將上清液并入預(yù)先稱重的50 mL離心管(w2)中,39 ℃恒溫干燥,稱重(w3),油脂提取采用Bligh & Dyer法[18],油脂含量(%)計(jì)算公式如下:

油脂含量(%)=(w3-w2)/w1×100

1.4脂肪酸成分分析

將上述提取油脂加入2 mL 3%硫酸-甲醇進(jìn)行甲酯化,70 ℃水浴冷凝回流4 h,取2 mL正己烷萃取4 h,取正己烷相進(jìn)行GC-MS分析脂肪酸組成。Agilent7890執(zhí)行GC-MS分析;色譜條件:HP-5MS色譜柱,高純氦氣載氣,1.0 mL/min流速。二階升溫程序:170 ℃保持0 min,然后10 ℃/min到190 ℃,持續(xù)1 min;進(jìn)樣量為1 μL分流進(jìn)樣,分流比40∶1,進(jìn)樣口溫度250 ℃。質(zhì)譜條件:EI離子源溫度為230 ℃,四級桿溫度為150 ℃,溶劑延遲2 min;質(zhì)量掃描范圍為50～550 amu。選用NIST08.L數(shù)據(jù)庫,計(jì)算各組分的相對百分含量采用峰面積歸一化法。

1.5油脂分級

將藻粉添加硅膠、氯仿,充分?jǐn)嚢柚粮煞蹱?均勻地加入層析柱中,再加適當(dāng)?shù)娜軇_洗,連續(xù)不斷地緩慢倒入柱內(nèi),任其自由流下,保持適當(dāng)流速。依次以氯仿、丙酮、甲醇梯度洗脫(體積比為6∶4∶4),分別提取中性脂、糖脂、磷脂[19],分析各組分。

1.6數(shù)據(jù)處理

全部實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行,利用ANOVA(SPSS 19.0)一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較,檢驗(yàn)調(diào)查不同實(shí)驗(yàn)的組間差異,且當(dāng)p<0.05具有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1單針藻QLY-1的自養(yǎng)和異養(yǎng)

由表1可知,單針藻QLY-1與同屬的藻類相比油脂含量較高,可作為生產(chǎn)生物柴油的原料[9,17,19]。然而在自養(yǎng)條件下,其生物量和油脂產(chǎn)率較低,采用兩階段的培養(yǎng)方式可能有助于提高微藻的生物量和油脂產(chǎn)率。

表1 單針藻QLY-1在自養(yǎng)條件下的 生物量產(chǎn)量、生物量產(chǎn)率、油脂含量及油脂產(chǎn)率Table 1 Biomass production,biomass productivity, lipid content and lipid productivity of Monoraphidium sp. QLY-1 under photoautotrophic condition

由圖1可以看出,單針藻QLY-1在異養(yǎng)條件下,前4 d生物量增長緩慢;培養(yǎng)第4～8 d進(jìn)入對數(shù)生長期,快速積累生物量;培養(yǎng)8～10 d生長率呈下降趨勢,藻體已經(jīng)進(jìn)入穩(wěn)定期,逐漸停止增長;微藻生物量持續(xù)增加,表明微藻通過異養(yǎng)可以顯著提高生物量。

圖1 單針藻在異養(yǎng)條件下的生物量及油脂含量Fig.1 The biomass and lipid content of Monoraphidium sp. QLY-1 during heterotrophic process

在自養(yǎng)條件下,單針藻QLY-1脂含量為52.79%±1.83%,但其生物量以及油脂產(chǎn)率很低;因此,QLY-1的生物量以及油脂產(chǎn)率需進(jìn)一步提高。由圖1可以看出,異養(yǎng)階段結(jié)束,生物量達(dá)到了(5.54±0.22) g/L,生物量產(chǎn)率達(dá)到了(554±22) mg/L/d,比自養(yǎng)條件下提高了24.24倍(p<0.01);該產(chǎn)率也高于Yu等相關(guān)研究報告結(jié)果的396 mg/L/d[17]。異養(yǎng)油脂產(chǎn)率(124.48±4.4) mg/L/d是自養(yǎng)的10.74倍(p<0.01);但是,異養(yǎng)階段油脂含量低;這與Fan 等人的研究結(jié)果相似[20]。

2.2不同濃度甜菜堿對單針藻QLY-1生物量以及脂含量的影響分析

由圖2可以看出,在不同濃度甜菜堿的誘導(dǎo)條件下,生物量和油脂含量均高于對照。當(dāng)甜菜堿濃度為5 mmol/L時,生物量和油脂含量均達(dá)到了最高值。研究甜菜堿對微藻油脂積累的影響可知，誘導(dǎo)第1 d油脂快速積累;甜菜堿誘導(dǎo)第3 d與對照相比較5、10、20 mmol/L甜菜堿處理組,油脂含量分別增加了29.06%(p<0.01),19.55%(p<0.05)以及8.7%,由此說明甜菜堿可以有效地提高單針藻QLY-1的油脂含量。Yang等研究了通過自養(yǎng)兩階段加鹽誘導(dǎo)的方法提高單針藻MonoraphidiumdybowskiiLB50的油脂產(chǎn)率,其油脂產(chǎn)率為46.21 mg/L/d[9];Fan等利用異養(yǎng)稀釋光誘導(dǎo)的方法提高小球藻C.vulgaris的油脂含量,其油脂產(chǎn)率可達(dá)85.43 mg/L/d[20]。結(jié)果表明,兩階段策略可以有效地提高微藻在不同脅迫條件下的生物量及油脂含量[9,16]。

圖2 不同濃度甜菜堿對單針藻 QLY-1生物量以及油脂含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of glycine betaine on the biomass and lipid content of Monoraphidium sp. QLY-1

2.35mmol/L甜菜堿對單針藻QLY-1脂肪酸組成的影響

由表2可以看出,添加5 mmol/L甜菜堿誘導(dǎo)的藻細(xì)胞,脂肪酸C16∶0、C18∶1以及C18∶2的含量超過65%,誘導(dǎo)后C16∶0的脂肪酸含量增加,單不飽和脂肪酸(主要是C18∶1)含量減少。此外,藻細(xì)胞脂肪酸組成和不飽和度均無顯著性變化,這與Li等利用褪黑素處理微藻后的結(jié)果一致[21]。因此,在光脅迫下,甜菜堿可能作為微藻的保護(hù)劑。

表2 單針藻QLY-1脂肪酸組成(%)Table 2 Fatty acids composition of the Monoraphidium sp.QLY-1(%)

注：ND:未檢測到；其他:C4∶0～C10∶0；*：同行差異顯著；不飽和度=單不飽和脂肪酸+2×多不飽和脂肪酸。

2.45mmol/L甜菜堿對單針藻QLY-1油脂分級的影響

圖3 單針藻QLY-1的油脂分級Fig.3 Lipid classes of Monoraphidium sp.QLY-1

結(jié)果表明,5 mmol/L的甜菜堿油脂分級中性脂、糖脂含量均高于對照;磷脂增加了1.49%,中性脂增加了12.83%(p<0.01),與糖脂降低的14.32%一致(圖3);推測在5 mmol/L甜菜堿處理下糖脂可能轉(zhuǎn)化為了中性脂[19]。添加外源甜菜堿微藻內(nèi)油脂含量顯著提升;但是,甜菜堿在微藻中詳細(xì)的誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚[22-23];甜菜堿作為一個植物生長調(diào)節(jié)劑,促進(jìn)了微藻中油脂的積累這可能與細(xì)胞內(nèi)ROS有關(guān)[24-26];也可能與碳固定以及油脂生物合成相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)[27],以上結(jié)論需要進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

自養(yǎng)、異養(yǎng)是工業(yè)上常用的微藻培養(yǎng)方法,本研究采用異養(yǎng)-光誘導(dǎo)的兩階段培養(yǎng)方式。結(jié)果表明,異養(yǎng)可在短期內(nèi)大幅提高微藻生物量;光脅迫下,添加外源甜菜堿有助于提高單針藻細(xì)胞中油脂積累,且在5 mmol/L甜菜堿誘導(dǎo)后,油脂含量可達(dá)47.37%。此外,添加外源甜菜堿提高了油脂中中性脂的含量,但對脂肪酸組成無顯著性影響。本文就甜菜堿對油脂積累的影響進(jìn)行了初步的研究,建立了植物生長調(diào)節(jié)劑甜菜堿與油脂合成啟動之間的聯(lián)系,相關(guān)的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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EffectsofglycinebetaineonlipidaccumulationofMonoraphidiumsp.QLY-1

LIDa-fei,ZHAOYong-teng,ZHAOPeng,XUJun-wei,LITao,YUXu-ya*

(Faculty of Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

For promoting biomass and lipid production inMonoraphidiumsp. QLY-1,this study investigated that the effects of glycine betaine(GB)on the growth and lipid accumulation in QLY-1 in combination with a two-step strategy,which was called heterotrophic and photoinduction cultivation. Results showed that the biomass concentration of heterotrophic and autotrophic algal cells were(5.54±0.22)and(0.878±0.12)g/L,respectively,and the heterotrophic cells was 5.3 folds higher than that of the autotrophic. Moreover,under high light stress,the lipid content(47.37%±2.93%)was enhanced by 0.29 folds(p<0.05)treated with 5 mmol/L glycine betaine than that of control(36.68%±1.34%). Further studies showed that the neutral lipid content was increased to 12.83%±0.75% than that of the control,and was no significant influences on the fatty acids composition under 5 mmol/L glycine betaine induction. The results indicated that glycine betaine could significantly increase the production of lipid in microalgae,combination of glycine betaine and two-step cultivation could act as another strategy for promoting the lipid accumulation in microalgae.

Monoraphidiumsp. QLY-1;lipid productivity;lipid content;glycine betaine;two-step strategy

2017-03-24

李大菲(1991-),男,碩士研究生,研究方向:微藻資源開發(fā),E-mail:dafei_likmust@163.com。

*

余旭亞(1969-),男,博士,教授,主要從事生物煉制方面的研究,E-mail:xuya_yu@163.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21266013)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)21-0110-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.023