, , ,,丹丹,, ,*

(1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.當陽市婦幼保健院檢驗科,湖北宜昌 444100; 3.襄陽出入境檢驗檢疫局綜合實驗室,湖北襄陽 441003)

常規(guī)食用調味面制品對青年志愿者腸道菌群多樣性影響

蔡宏宇1,王艷2,沈馨1,馬雪偉3,王丹丹1,余海忠1,郭壯1,*

(1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.當陽市婦幼保健院檢驗科,湖北宜昌 444100; 3.襄陽出入境檢驗檢疫局綜合實驗室,湖北襄陽 441003)

招募了9名在校大學生志愿者,每位志愿者每隔一天食用一包約150 g的調味面制品,持續(xù)2周累計食用7包,分別于食用前一日、食用完次日及2周后采集糞便樣品,并采用高通量測序技術對其腸道微生物群落結構進行解析。通過配對t檢驗發(fā)現(xiàn),食用調味面制品2周可以顯著提高志愿者腸道微生物的多樣性和豐富度(p<0.05),而對優(yōu)勢菌屬的相對含量沒有影響(p>0.05)。通過基于UniFrac距離的主坐標分析和基于Meta-Storm距離的非參數(shù)多元方差分析發(fā)現(xiàn),食用調味面制品2周不會對志愿者腸道菌群群落結構產(chǎn)生影響。

調味面制品,高通量測序,腸道微生物,青年

調味面制品,是以小麥粉為主要原料,經(jīng)配料、擠壓熟制、成型、調味而成的即食食品[1-2],該類產(chǎn)品鮮、咸、香、辣、油,口感十分豐富,深受青少年兒童的青睞,2015年銷售額達到500億[3]。調味面制品的生產(chǎn)包含油浸和調味等工藝環(huán)節(jié),具有高油、高鹽和辛辣的特點,且含有色素、甜味劑和防腐劑等食品添加劑。有報道指出調味面制品市場抽檢合格率一般在80%左右[3],加之質量安全問題偶有發(fā)生,因而在一定程度上引發(fā)了消費者的擔憂[4]。然而令人遺憾的是,目前關于調味面制品對食用者健康影響的報道尚少。

人體腸道中棲息著大量的共生菌群,且越來越多的研究證實腸道微生物和人體的健康息息相關,與肥胖[5]及痛風[6]、炎性腸病[7]、自閉癥[8]和糖尿病[9]等疾病的發(fā)生存在一定關系。同時腸道菌群亦易受膳食[10]、抗生素[11]和益生菌制劑[12]的影響。

近年來關于食用調味面制品是否對人體健康會產(chǎn)生影響存在較大的爭議,但多數(shù)觀點缺乏實驗驗證和數(shù)據(jù)支撐。眾所周知,調味面制品在被食用3～4 h后便進入腸道進行消化,同時其消化物可能對腸道微生物產(chǎn)生一定的影響,然而目前關于調味面制品對食用者腸道菌群影響的研究尚未見報道。本研究采用Miseq高通量測序技術,評價了食用調味面制品對青年志愿者腸道菌群多樣性的影響,以期為后續(xù)調味面制品的營養(yǎng)價值和安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

調味面制品 從襄陽市隆中鑫源超市和學子超市購買7個品名的調味面制品,每袋產(chǎn)品包裝標注凈重均為158 g;QIAamp DNA Stool Mini Kit糞便DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司;5×TransStartTM FastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix 北京全式金生物技術有限公司;DNA 1000試劑盒 美國Agilent公司。

5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司;DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠;2100芯片生物分析儀 美國Agilent公司;Miseq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.2實驗方法

1.2.1 志愿者招募 本研究共招募志愿者9名,編號為1#～9#,其中1#～5#為女性,6#～9#為男性,在實驗前每位志愿者均簽署了知情同意書。志愿者年齡在19～21歲,體重正常(BMI=18.5～24.9 kg·m-2),近一個月未服用抗生素或發(fā)酵類食品。

1.2.2 調味面制品食用及樣品采集 每位志愿者每隔一天食用一包調味面制品,持續(xù)2周累計食用7包,且不同品名調味面制品食用順序一致。分別于食用前一日(食用前組),食用完7包調味面制品次日(食用2周組),及最后一次食用調味面制品后2周(停食后2周組)采集志愿者糞便樣品,置于-80 ℃保藏備用。

1.2.3 DNA提取和PCR擴增 使用糞便DNA提取試劑盒提取微生物宏基因組,完整度、純度及濃度均滿足后續(xù)實驗要求的DNA樣品暫存到-20 ℃冰箱備用。

PCR擴增體系為:5×PCR緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL,5 μmol/L正向引物0.8 μL,5 μmol/L反向引物0.8 μL,5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL,DNA模板10 ng,體系用ddH2O補充至20 μL。其中正向引物為338F(5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCA-3′),反向引物為806R(5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′),且在正向引物中加入7個核苷酸標簽(barcode)。

擴增條件為:首先95 ℃變性3 min,然后95 ℃變性30 s,55 ℃延伸30 s,72 ℃退火45 s后重復35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物置-20 ℃冰箱備用。

1.2.4 樣品平衡及Miseq高通量測序 使用Agilent DNA 1000試劑盒,按照100 nmol/L的濃度對DNA模板進行稀釋,寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq平臺進行高通量測序。

1.2.5 序列優(yōu)化及質控 Miseq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù),首先根據(jù)成對序列之間的重疊(overlap)關系,將其拼接(merge)成一條序列,繼而從序列尾部設置50 bp的窗口并計算該窗口內(nèi)堿基質量值的平均值,若該值小于20則切掉窗口內(nèi)最后一個堿基,同時窗口向序列頭部移動一個堿基,并繼續(xù)計算窗口內(nèi)50 bp堿基的平均值,直至窗口內(nèi)堿基平均得分大于20為止,然后根據(jù)barcode將所有序列劃分到各個樣品,并對序列方向進行校正,最后使用切掉barcode和引物的序列進行生物信息學分析。在序列拼接過程中,若overlap區(qū)的堿基數(shù)小于10 bp或最大錯配比率大于0.2,則該對序列予以剔除。拼接好的序列若存在barcode堿基錯配或引物堿基錯配數(shù)大于2 bp,則亦予以剔除。同時本研究要求切掉barcode和引物后的序列其堿基數(shù)大于等于50 bp。

1.2.6 生物信息學分析 質控后的序列使用QIIME(v1.7.0)分析平臺進行物種和多樣性分析[13],主要的處理流程為:

使用PyNAST校準排齊序列[14],在序列100%相似性下進行UCLUST歸并,建立無重復的16s rRNA全長序列集[15];

在序列97%相似度下進行分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)劃分;

使用ChimeraSlayer去除可能存在嵌合體的OTU[16];

使用RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)[17]和Greengenes(Release 13.8)[18]數(shù)據(jù)庫對OTU代表性序列進行同源性比對,整合兩個數(shù)據(jù)庫的比對結果,確定每個OTU最終的分類學地位;

使用FastTree軟件[19]繪制基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹,隨后計算樣品的α和β多樣性。

1.2.7 多元統(tǒng)計學分析 使用配對t檢驗對食用調味面制品不同階段志愿者腸道菌群的豐富度指標、多樣性指標和基于門屬分類地位的細菌相對含量進行顯著性分析,使用維恩(Venn)圖對不同分組樣品中特有或共有的OTU數(shù)量進行表示;使用基于UniFrac距離的主坐標分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA)和非參數(shù)多元方差分析(PERMANOVA)對食用調味面制品不同階段志愿者腸道菌群群落結構進行分析。使用Origin 8.5軟件和R軟件(v3.3.2)對QIIME產(chǎn)生的結果進行分析和可視化處理。

1.2.8 核酸登錄號 本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫,登錄號為mgp21723。

2 結果與分析

2.1序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的27個樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量如表1所示。

由表1可知,通過Miseq高通量測序,本研究采集的27個樣品共產(chǎn)生了980088條高質量16S r RNA序列,平均每個樣品產(chǎn)生36300條(范圍為30289～44263,標準差為4250)。經(jīng)過100%序列鑒定聚類分析后,本研究共得到497684條代表性序列,根據(jù)序列的97%相似性進行操作分類單元劃分后,共得到87973個OTU,經(jīng)嵌合體檢測后去除了45.29%的OTU,還剩余48128個OTU,每個樣品平均剩余3700個OTU(范圍為2225～7262,標準差為1326)。

本研究將所有的序列鑒定為28個門,76個綱,119個目,236個科和498個屬。值得一提的是,本研究有45.97%的OTU和16.44%的序列(范圍為6.53%～47.30%,標準差為10.48%)不能鑒定到屬水平。

只有盡可能多的獲取高質量的16s rRNA序列,才可以更全面的捕獲樣本中的微生物信息,因而本研究產(chǎn)生的序列數(shù)是否滿足后續(xù)生物信息學的分析,是一個值得關心的問題[20]。研究人員通常采用稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)圖對樣本中微生物的豐富度和多樣性進行了評價,納入本研究27 個樣品的稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)圖如圖1所示。

由圖1(A)可知,雖然隨著序列數(shù)的增多本研究捕獲新物種的數(shù)量亦隨之增加,然而由圖1(B)可知,每個樣品的香農(nóng)多樣性曲線已經(jīng)進入平臺期。由此可見,隨著測序量的進一步增加盡管新的微生物種系型可能會被發(fā)現(xiàn),但微生物的多樣性已經(jīng)不再隨之發(fā)生變化了,因而本研究的測序量是滿足后續(xù)生物信息學分析要求的[21]。

由圖1亦可知,每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周及停食2周后志愿者腸道菌群的豐富度和多樣性均高于食用前,這在一定程度上說明食用調味面制品可能增加了志愿者腸道菌群的豐富度和多樣性。Chao1和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)(Observed speices)指數(shù)常用來計算樣本中菌群的豐富度,而香農(nóng)(Shannon)和辛普森(Simpson)指數(shù)常用來計算多樣性[22]。由表1亦可知,單個樣品用于劃分OTU的最小序列數(shù)為19706條,本研究進一步計算了在測序量達到該數(shù)值時,各樣品中微生物的Chao1、Observed speices、Shannon和Simpson指數(shù),其結果如表2所示。

表2 食用調味面制品不同階段志愿者腸道菌群豐富度和多樣性指數(shù)比較分析Table 2 Comparison of richness and diversity indices among gut microbiota of volunteers in different stages of consumption of seasoned flour products

圖1 稀疏曲線圖(A)和香農(nóng)指數(shù)圖(B)Fig.1 Rarefaction analysis(A)and shannon diversity estimates(B)of the high throughput sequencing

注：a,中位數(shù),(最小值-最大值);b,表中I、II和III分別代表食用調味面制品前、食用2周和停食后2周。

由表2可知,每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周后志愿者腸道菌群的豐富度和多樣性均顯著增大(p<0.05),且停食2周后腸道菌群的豐富度和多樣性較之食用期間均不會發(fā)生顯著的變化(p>0.05)。

2.2基于OTU水平食用調味面制品對腸道菌群影響的分析

由序列豐富度和多樣性分析可知,每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周后志愿者腸道菌群的豐富度和多樣性會隨之增大,因α多樣性分析是基于OTU水平的,故而本研究進一步在OTU水平上探討了食用調味面制品對腸道菌群的影響?；贠TU水平的Venn圖如圖2所示。

圖2 基于OTU水平的Venn圖Fig.2 Venn diagram based on OTU table

由圖2可知,在食用調味面制品不同階段樣品中均至少出現(xiàn)一次的OTU共有5004個,僅占OTU總數(shù)的10.40%,而這些OTU所包含的序列數(shù)為746675條序列,占所有質控后合格序列數(shù)的76.18%。其中,27個樣品均含有44個OTU,僅占OTU總數(shù)的0.091%,但其包含的序列數(shù)為163324 條序列,占所有質控后合格序列數(shù)的16.66%。值得一提的是,僅在調味面制品食用前、食用2周或停食2周樣品中出現(xiàn)的OTU數(shù)分別為7469個、14069個和15982個,各占OTU總數(shù)的15.52%、29.23%和33.21%,其所包含序列數(shù)分別為8513條、15565條和18053條,僅占所有質控后合格序列數(shù)的0.87%、1.59%和1.84%。本研究進一步統(tǒng)計了OTU在27個樣品中出現(xiàn)的次數(shù),其結果如圖3所示。

圖3 OTU在27個樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計Fig.3 Distribution of OTU as a function of their prevalence in the 27 individuals

由圖3可知,納入本研究的27個樣品共產(chǎn)生48128個OTU,然而在27個樣品中僅出現(xiàn)1 次的OTU為36066個,占OTU總數(shù)的74.93%,所包含序列數(shù)為38270條,僅占所有質控后合格序列數(shù)的3.90%。值得一提的是,在27個樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU平均每個含有1.1條序列,以本研究中每個樣品平均產(chǎn)生36300條序列計算,每個僅出現(xiàn)1次的OTU其平均相對含量僅為0.0030%。由此可見,雖然食用調味面制品后腸道菌群的種系型增多了,但所增加的種系型其相對含量是極低的。

2.3基于門屬水平食用調味面制品對腸道菌群影響的分析

納入本研究的27位志愿者腸道菌群含量最多的4個細菌門分別為Firmicutes(55.52%)、Bacteroidetes(30.00%)、Proteobacteria(5.82%)和Actinobacteria(4.08%),其余24個細菌門的相對含量累計為2.57%。經(jīng)配對t檢驗發(fā)現(xiàn),使用調味面制品不同階段,上述28個細菌門的相對含量差異均不顯著(p>0.05)。使用高通量測序技術對樣本微生物多樣性進行研究時,通常將相對含量大于1.0%的屬定義為優(yōu)勢菌屬,且不同群體間菌屬相對含量的差異性分析亦主要基于優(yōu)勢菌屬進行[23-24]。基于屬水平食用調味面制品不同階段志愿者腸道中細菌相對含量的比較分析如圖4所示。

圖4 基于屬水平食用調味面制品不同階段志愿者 腸道中細菌相對含量的比較分析Fig.4 Relative abundances of the major bacterial genera among gut microbiota of volunteers in different stages of consumption of seasoned flour products

由圖4可知,納入本研究的青年志愿者腸道中隸屬于Firmicutes且相對含量大于1.0%的細菌屬及其含量分別為:Faecalibacterium(8.89%)、Eubacterium(6.14%)、Blautia(5.15%)、Ruminococcus(4.58%)、Roseburia(4.40%)、Dialister(3.09%)、Clostridium(2.77%)、Megamonas(1.80%)、Gemmiger(1.48%)、Phascolarctobacterium(1.47%)、Dorea(1.42%)和Megasphaera(1.34%)。隸屬于其他細菌門且相對含量大于1.0%的還包括:Actinobaceria的Bifidobacterium(2.82%);Bacteroidetes的Prevotella(14.68%)和Bacteroides(10.41%)。綜上所述,上述15個優(yōu)勢細菌屬中14個隸屬于Firmicutes或者Bacteroidetes,其相對含量累計為67.61%。由此可見,納入本研究的青年志愿者腸道菌群主要是由若干個隸屬于硬壁菌門和擬桿菌門已知的優(yōu)勢細菌屬組成,這與以往關于中國健康人群腸道菌群構成的研究報道結論相一致[25]。經(jīng)配對t檢驗發(fā)現(xiàn),使用調味面制品不同階段,上述15個優(yōu)勢細菌屬的相對含量差異均不顯著(p>0.05)。由此可見,食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周不會對青年志愿者腸道中優(yōu)勢菌屬的相對含量產(chǎn)生影響。

通過配對t檢驗,本研究發(fā)現(xiàn)食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周后青年志愿者腸道中隸屬于Actinomyces、Alkaliphilus、Allochromatium、Bacillus、Cronobacter、Desulfomicrobium、Fusibacter、Ignavibacterium、Leptothrix、Paenibacillus和Reyranella的細菌其相對含量會發(fā)生顯著的變化(p<0.05)。值得一提的是,上述11個細菌屬在志愿者腸道中的平均含量均小于1%,且范圍在0.013%～0.204%之間,不屬于優(yōu)勢細菌屬,因而本研究不再對其進行進一步的探討。

2.4食用調味面制品對青年志愿者腸道菌群群落結構的影響

本研究進一步采用兩步UCLUST法構建了OTU矩陣,并采用基于UniFrac距離的PCoA對食用調味面制品不同階段志愿者腸道菌群群落結構變化進行了分析,其結果如圖5所示。

圖5 基于UniFrac距離的非加權(A)和加權(B) PCoA的志愿者腸道菌群群落結構分析Fig.5 PCoA of gut microbiota of volunteers based on unweighted and weighted UniFrac

由圖5可知,基于UniFrac距離的非加權和加權的主坐標分析其第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為12.90%和5.65%、35.98%和24.75%,不同志愿者食用調味面制品同一階段的樣品均未呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢。值得一提的是,同一志愿者食用調味面制品不同階段的樣品呈現(xiàn)出了一定的聚類趨勢,其中較為明顯的為9#志愿者。因而我們可以定性的認為每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周可能對志愿者的腸道菌群群落結構影響較小,其影響遠小于志愿者個體之間的差異。為了對這一結論進行驗證,本研究采用基于Meta-Storm距離的PERMANOVA對調味面制品食用情況、個體差異及性別對青年志愿者腸道菌群變化的影響進行了定量分析,其結果如圖6所示。

圖6 不同因素對青年志愿者腸道菌群變化的影響Fig.6 Contributions of different factors on young volunteers gut microbiota variation

由圖6可知,調味面制品食用情況對志愿者腸道菌群變化影響不顯著(F=0.79,p=0.60)。由此可見,每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周不會對青年志愿者腸道菌群的多樣性產(chǎn)生影響。由圖6亦可知,性別因素不會對志愿者的腸道菌群群落結構變化產(chǎn)生顯著影響(F=0.76,p=0.54),而志愿者個體之間腸道菌群群落結構差異極顯著(F=2.98,p<0.001),這均與基于UniFrac距離的PCoA結果一致。

3 討論

由序列豐富度和多樣性分析發(fā)現(xiàn),食用調味面制品可以顯著提高志愿者腸道菌群的豐富度和多樣性,而經(jīng)PCoA和PERMANOVA均發(fā)現(xiàn)每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周對志愿者的腸道菌群群落結構沒有顯著的影響。本研究認為造成此種現(xiàn)象的主要原因在于,食用調味面制品后志愿者腸道菌群的種系型增加了,但由于種系型的相對含量較低因而無法對腸道菌群群落結構的整體變化產(chǎn)生影響。隨著食用調味面制品時間的延長或食用量的增大,這些種系型的含量可能會隨之增加,亦可能最終會改變食用者腸道菌群的群落結構,但該推論尚需進一步的實驗驗證。此外,由于調味面制品生產(chǎn)工藝簡單、設備投入低,因而調味面制品生產(chǎn)企業(yè)存在門檻低、產(chǎn)品質量參差不齊的特點,然而由于各種因素限制,本研究僅采集了7個品名的調味面制品,且生產(chǎn)企業(yè)在行業(yè)內(nèi)均具有較高的知名度,這也可能是導致上述現(xiàn)象發(fā)生的原因之一。

4 結論

每2 d食用150 g左右調味面制品持續(xù)2周后,青年志愿者腸道菌群的豐富度和多樣性均顯著增大,但由于增加種系型的相對含量較低,而青年志愿者腸道中優(yōu)勢菌屬的相對含量和菌群結構均未發(fā)生顯著變化。

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Effectofconsumptionofseasonedflourproductsongutmicrobiotainyoungvolunteers

CAIHong-yu1,WANGYan2,SHENXin1,MAXue-wei3,WANGDan-dan1,YUHai-zhong1,GUOZhuang1,*

(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food,School of Chemical Engineering and Food Science,Hu Bei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China; 2.Inspection Department,Dangyang City Maternal and Child Health Hospital,Yichang 444100,China; 3.Xiangyang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau Comprehensive Laboratory,Xiangyang 441003,China)

In the current study,9 young volunteers were recruited and each subject consumption of a packet of seasoned flour products with the weight of 150 g for a continuous period of 2 weeks. Meanwhile,gut microbiota of subjects were monitored before starting,during and after stopping consumption for 2 weeks using high throughput sequencing technologies. The result indicated that consumption of seasoned flour products for 2 weeks significantly increased the gut microbiota diversity and richness by paired t test(p<0.05),but had no influence on the relative abundance of domain bacterial genus(p>0.05). Through principal coordinate analysis based on UniFrac and PERMANOVA based on Meta-Storm,it was shown that the consumption of seasoned flour products for 2 weeks couldn’t alter the structural of gut microbiota.

seasoned flour products;high throughput sequencing;gut microbiota;young

2017-04-18

蔡宏宇(1996-)，女，本科生，研究方向：食品生物技術，E-mail：1486721051@qq.com。

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郭壯(1984-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：guozhuang1984@163.com。

湖北省荊楚卓越工程師協(xié)同育人計劃(201657)；湖北文理學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2017)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)21-0289-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.057