黃 瓊，劉華慶，侯 文，楊 華，劉 圣

邁新·技術(shù)交流

不同保存年限乳腺癌石蠟標(biāo)本中HER-2 FISH檢測(cè)結(jié)果的比較

黃 瓊，劉華慶，侯 文，楊 華，劉 圣

乳腺腫瘤；石蠟標(biāo)本；HER-2

乳腺癌HER-2狀態(tài)在對(duì)預(yù)后判斷及篩選靶向治療患者方面具有重要意義，因此準(zhǔn)確檢測(cè)和判讀HER-2狀態(tài)顯得尤其重要；HER-2狀態(tài)目前多用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)對(duì)HER-2基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，其具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2014)[1]對(duì)標(biāo)本類型、標(biāo)本固定及固定液、組織切片均有要求，但對(duì)石蠟標(biāo)本保存年限并未作明確規(guī)定，本文對(duì)究竟保存多長(zhǎng)時(shí)間的石蠟標(biāo)本對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響做了進(jìn)一步的探討。

1 材料與方法

1.1材料收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2006年1月～2010年12月存檔的浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本，且免疫組化標(biāo)記HER-2蛋白表達(dá)(3+)者每年10例，(2+)者每年5例，共75例標(biāo)本進(jìn)行了HER-2的FISH檢測(cè)。

1.2儀器與試劑熒光顯微鏡(Olympus BX53)，原位雜交儀(Thermo Brite)，石蠟切片機(jī)(Leica RM2245)，數(shù)字酸度計(jì)(上海大普公司，PHS-25B型)，三孔水浴鍋(上海躍進(jìn)公司，DK-8D)。HER-2探針試劑盒和預(yù)處理試劑盒購(gòu)于雅培公司。

1.3方法(1)4 μm厚石蠟切片，二甲苯脫蠟3次×10 min，無(wú)水乙醇2次×5 min，空氣干燥。(2)預(yù)熱預(yù)處理液至80 ℃，放入切片10 min，室溫純水洗3 min。(3)切片放入預(yù)熱至37 ℃的酶溶液15～20 min，室溫純水洗3 min，37 ℃干燥。(4)70%乙醇、85%乙醇、無(wú)水乙醇脫水各1 min，37 ℃干燥。(5)暗室內(nèi)在樣本區(qū)域加探針10 μL，蓋上蓋玻片，橡膠膠水四周封固，將切片放入雜交儀中，75 ℃ 5 min，37 ℃ 16 h。(6)用鑷子去除橡膠膠水，浸入室溫洗滌液，直到蓋玻片脫落；再放入預(yù)熱至72 ℃的洗滌液中2 min，取出37 ℃干燥。(7)加DAPI 10 μL，蓋上蓋玻片，-20 ℃放置30 min。(8)取出切片恢復(fù)至室溫，在暗室中熒光顯微鏡下閱片。

1.4FISH檢測(cè)結(jié)果判定參照乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2014)對(duì)FISH的染色要求和結(jié)果判讀：先對(duì)HE染色切片中的癌細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行確定，選擇細(xì)胞核大小一致，核邊界完整，DAPI染色均一，細(xì)胞核無(wú)重疊，信號(hào)清晰的細(xì)胞，至少找到2個(gè)浸潤(rùn)癌區(qū)域，隨機(jī)至少計(jì)數(shù)20個(gè)浸潤(rùn)癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)。(1)當(dāng)HER-2/CEP17比值≥2.0時(shí)，為HER-2陽(yáng)性；HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0時(shí)也為HER-2陽(yáng)性。(2)HER-2/CEP17比值<2.0且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0時(shí)為HER-2陰性。(3)HER-2/CEP17比值<2.0且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0，但≥4.0時(shí)為HER-2結(jié)果不確定。

2 結(jié)果

對(duì)檢測(cè)的75例樣本進(jìn)行評(píng)估(表1)，結(jié)果顯示保存6年的石蠟標(biāo)本出現(xiàn)2例陰性，但內(nèi)對(duì)照紅綠信號(hào)正常，對(duì)檢測(cè)基本無(wú)影響；保存7年的部分標(biāo)本信號(hào)減弱，3例陰性；保存8年的標(biāo)本信號(hào)減弱更明顯，5例陰性；保存9年的標(biāo)本7例有極弱的信號(hào)但鏡下可判定為陽(yáng)性，另外8例陰性；保存10年的標(biāo)本有1例鏡下可判定為陽(yáng)性，其他標(biāo)本可見(jiàn)極少、極弱的紅綠信號(hào)，部分標(biāo)本內(nèi)對(duì)照紅綠信號(hào)消失。陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度和數(shù)量隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變?nèi)鹾蜏p少(圖1～3)。

3 討論

確診為浸潤(rùn)性乳腺癌的患者均應(yīng)行HER-2檢測(cè)，利于患者的預(yù)后判斷和靶向治療；陽(yáng)性患者使用曲妥珠單抗藥物可以提高腫瘤對(duì)藥物的反應(yīng)性，增加了無(wú)進(jìn)展生存期和總生存時(shí)間，降低乳腺癌患者的復(fù)發(fā)率和病死率。FISH是目前認(rèn)為檢測(cè)乳腺癌HER-2的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)時(shí)應(yīng)提供保存合格的標(biāo)本，以提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。假陰性結(jié)果可能使曲妥珠單抗治療潛在獲益患者失去治療機(jī)會(huì)；假陽(yáng)性結(jié)果則會(huì)導(dǎo)致患者持續(xù)1年治療無(wú)效，付出高昂費(fèi)用并可能產(chǎn)生毒副作用[2]。

部分患者由于確診時(shí)間較長(zhǎng)，或由于當(dāng)時(shí)不具備FISH檢測(cè)條件，以及復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后無(wú)法重新取材，只能用首次診斷的標(biāo)本來(lái)檢測(cè)，那么保存多久的石蠟標(biāo)本對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，目前還沒(méi)有明確的時(shí)間界定。本文希望能從檔案石蠟標(biāo)本中找出從雜交信號(hào)開(kāi)始減弱直到信號(hào)消失的時(shí)間點(diǎn)，以確保檢測(cè)標(biāo)本的可靠性及結(jié)果的真實(shí)性。

表1 不同保存年限石蠟標(biāo)本的HER-2 FISH檢測(cè)情況

①A①B②A②B③A③B

圖1A.2010年乳腺癌標(biāo)本HER-2基因呈簇狀擴(kuò)增，橘紅色，信號(hào)強(qiáng)；B.CEP17信號(hào)為綠色，圖像組合后紅綠信號(hào)對(duì)比明顯，F(xiàn)ISH檢測(cè)

圖2A.2008年乳腺癌標(biāo)本HER-2基因呈簇狀擴(kuò)增，橘紅色，信號(hào)較弱；B.CEP17信號(hào)為綠色，圖像組合后紅色信號(hào)較弱且簇狀不明顯，F(xiàn)ISH檢測(cè)圖3A.2006年乳腺癌標(biāo)本HER-2基因單個(gè)散在不呈簇，橘紅色，信號(hào)很弱；B.CEP17信號(hào)為綠色，圖像組合后紅色信號(hào)不明顯，F(xiàn)ISH檢測(cè)

由于FISH技術(shù)的開(kāi)展比免疫組化晚，且探針價(jià)格比抗體昂貴，還需要配備熒光顯微鏡和暗室，患者需要承擔(dān)更多的費(fèi)用，故HER-2檢測(cè)在FISH普及前多采用免疫組化進(jìn)行HER-2蛋白檢測(cè)。但FISH具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性，結(jié)果判定客觀，主觀影響很小，一致性極高，能更準(zhǔn)確真實(shí)地反映HER-2的擴(kuò)增狀態(tài)。對(duì)保存時(shí)間較長(zhǎng)的蠟塊，多數(shù)病例僅行免疫組化。張虹等[3]認(rèn)為免疫組化和FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果的一致性中陰性一致率為100%，陽(yáng)性一致率為96.24%。Press等[4]研究顯示HER-2蛋白檢測(cè)結(jié)果為免疫組化(3+)的病例中，F(xiàn)ISH的陽(yáng)性率為78.2%～98.9%。朱文標(biāo)等[5]認(rèn)為免疫組化檢測(cè)為0、1+、2+、3+中FISH的符合率分別為100%、100%、45.45%、96.55%。臨床上HER-2免疫組化(3+)的病例可直接用藥，若經(jīng)濟(jì)條件許可，也可進(jìn)一步進(jìn)行HER-2 FISH檢測(cè)，以排除試劑和人為判讀因素；但對(duì)于免疫組化(2+)的病例，必須做HER-2 FISH檢測(cè)才能確認(rèn)是否可用靶向藥物治療，故本文選用免疫組化檢測(cè)為(3+)和(2+)的病例來(lái)進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。消化只是一個(gè)時(shí)間段，并無(wú)固定值，組織標(biāo)本之間的個(gè)體差異以及不同實(shí)驗(yàn)室制片過(guò)程的差異，如切片厚度、固定時(shí)間等均可能使消化時(shí)間發(fā)生改變，要統(tǒng)一用相同的消化時(shí)間幾乎是不可能的[6]。消化時(shí)間還與蠟塊保存時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，甲醛使DNA或蛋白質(zhì)的氨基團(tuán)之間形成網(wǎng)橋從而固定標(biāo)本，但保存時(shí)間越長(zhǎng)，交聯(lián)作用形成的大分子網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定，消化時(shí)間也需要延長(zhǎng)；即使是同一保存時(shí)間的標(biāo)本由于所含腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)成分的多少不同，消化時(shí)間也不一致。對(duì)保存6～10年的石蠟標(biāo)本消化15～20 min多數(shù)較為理想，每張切片消化時(shí)均應(yīng)在顯微鏡下控制，在細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、清晰的基礎(chǔ)上充分消化，然后再行FISH檢測(cè)，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)保存6年(含6年)以上存檔的浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本，且免疫組化HER-2蛋白表達(dá)(3+)和(2+)的75例樣本進(jìn)行了FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示保存6年的石蠟標(biāo)本對(duì)檢測(cè)基本無(wú)影響；保存7至10年的標(biāo)本擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱，數(shù)量逐漸減少。保存6～10年的石蠟標(biāo)本的陽(yáng)性率逐漸降低，分別為86.7%、80.0%、66.7%、46.7%、6.7%；保存時(shí)間較長(zhǎng)的一些病例細(xì)胞核邊緣模糊，結(jié)構(gòu)不清，信號(hào)極弱，無(wú)法進(jìn)行結(jié)果判讀。但因試劑昂貴，每年檢測(cè)的病例數(shù)偏少，可能出現(xiàn)免疫組化陽(yáng)性而FISH陰性或免疫組化可疑而FISH陽(yáng)性等情況，在條件允許的情況下應(yīng)多增加檢測(cè)樣本數(shù)，以進(jìn)一步保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

用保存6年(含6年)以內(nèi)的浸潤(rùn)性乳腺癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行FISH檢測(cè)對(duì)結(jié)果無(wú)影響；保存10年及以上年限的樣本不應(yīng)再行FISH檢測(cè)；6～9年的樣本盡量不用，若用來(lái)檢測(cè)但結(jié)果為陰性時(shí)，應(yīng)結(jié)合免疫組化檢測(cè)結(jié)果，或重新取材，或用其他的檢測(cè)方法進(jìn)行HER-2檢測(cè)。

[1] 《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2014版)》編寫(xiě)組. 乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2014版)[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2014,43(4):262-266.

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[3] 張 虹, 張 爽, 王 穎, 等. 運(yùn)用2013版美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)/美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)乳腺癌HER-2檢測(cè)指南對(duì)1501例浸潤(rùn)性乳腺癌的HER-2狀態(tài)進(jìn)行再評(píng)估[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2015,44(1):42-47.

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1001-7399(2017)10-1163-03

時(shí)間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.028.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.028

接受日期：2017-07-27

遵義市科技計(jì)劃課題[遵市科合社字(2014)62號(hào)]

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黃 瓊，女，技師。Tel: (0851)28608053，E-mail:673744387@qq.com

劉華慶，男，主任技師，通訊作者。Tel: (0851)28608053，E-mail: liuhuaqing818@163.com