趙建通,張磊,劉文瞻,徐飛,郭明濤,路志民,肖波

(1.邯鄲市第一醫(yī)院 泌尿一科,河北 邯鄲 056000;2.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊050012)

姜黃素通過Erk1/2信號通路抑制人腎癌細(xì)胞786-O在裸鼠體內(nèi)增殖

趙建通1,張磊2,劉文瞻1,徐飛1,郭明濤1,路志民1,肖波1

(1.邯鄲市第一醫(yī)院 泌尿一科,河北 邯鄲 056000;2.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊050012)

目的:探討姜黃素對786-O細(xì)胞在體內(nèi)增殖的抑制效果及其可能機(jī)制.方法:將人腎癌細(xì)胞786-O接種裸鼠,成瘤后將裸鼠隨機(jī)分為2組,干預(yù)組給予姜黃素干預(yù)治療,對照組則采用PBS對照治療.測定干預(yù)組腫瘤的抑制率,并采用Western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測p-Erk1/2和p-Akt表達(dá).結(jié)果:經(jīng)過連續(xù)20 d給藥治療,干預(yù)組裸鼠的瘤體平均質(zhì)量為(1.03±0.17)g,對照組裸鼠的瘤體平均質(zhì)量為(2.46±0.48)g,2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02).采用姜黃素干預(yù)后小鼠的腫瘤抑制率達(dá)58.13%.Western blot及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均證實(shí)干預(yù)組裸鼠瘤內(nèi)Erk1/2的磷酸化水平顯著低于對照組(P<0.01),而2組Erk1/2、Akt及p-Akt表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)論:姜黃素具有較好的抑制腫瘤生長的效果,通過抑制Erk1/2的磷酸化,進(jìn)而抑制人腎癌細(xì)胞786-O在裸鼠體內(nèi)增殖.

姜黃素;人腎癌細(xì)胞;Erk1/2;Akt;體內(nèi)

姜黃素(curcumin)是一種天然的酚性化合物[1],市售的姜黃素大多是從姜科姜黃屬中草藥植物中提取的,如姜黃、莪術(shù)、郁金和石菖蒲等[2].姜黃素的臨床藥理學(xué)作用較為廣泛,包括抗炎[3]、抗病毒[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]、抗氧化[6]等.近些年來越來越多報(bào)道表明姜黃素具有較好的抗腫瘤效果[7],研究證實(shí)姜黃素可以抑制結(jié)腸癌[8]、肺癌[9]及胰腺癌[10]等腫瘤細(xì)胞的增殖. 但在腎癌方面的報(bào)道較為少見,本課題組前期研究已證實(shí)姜黃素對于人腎癌細(xì)胞786-O的體外抑制作用[11],為進(jìn)一步探索姜黃素在體內(nèi)的腫瘤抑制效果,本研究通過裸鼠皮下種植人腎癌細(xì)胞786-O,姜黃素連續(xù)治療后評估腫瘤抑制率,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料 人腎癌細(xì)胞786-O購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所,姜黃素購自成都思科華生物技術(shù)有限公司,SPF級BALB/c裸鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號:44002100011653),1640細(xì)胞培養(yǎng)基及FBS均購自美國HyClone公司,磷酸化的Erk1/2(p-Erk1/2)單克隆抗體及GAPDH內(nèi)參抗體購自美國CST公司,HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購自杭州弗德生物制藥有限公司,組織蛋白提取試劑盒購自北京康潤生物科技有限公司,其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 裸鼠成瘤及姜黃素干預(yù):裸鼠接種786-O細(xì)胞前2 h,采用胰酶消化培養(yǎng)的細(xì)胞,計(jì)數(shù)后將其稀釋至5X106個(gè)/200 μL,每只裸鼠頸背部皮下注射200 μL細(xì)胞懸液,接種7 d左右可以觀察到裸鼠背部明顯成瘤,在接種腫瘤細(xì)胞后第8天將10只裸鼠隨機(jī)分成2組,干預(yù)組裸鼠腹腔注射50 mg/kg姜黃素進(jìn)行治療,對照組裸鼠則注射等劑量的PBS.

1.2.2 腫瘤抑制率測定:在連續(xù)治療20 d后處死裸鼠,剝離皮下腫瘤進(jìn)行稱重,計(jì)數(shù)腫瘤的抑制率,抑制率計(jì)算方法為:(1-干預(yù)組裸鼠腫瘤平均重量/對照組腫瘤平均重量)X100%.

1.2.3 Western blot分析:采用試劑盒提取組織總蛋白,測定樣品蛋白濃度后,每個(gè)加樣孔上樣60 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后,采用5%脫脂奶37 ℃封閉2 h,PBST稀釋一抗,4 ℃孵育一抗過夜,PBST洗滌后,孵育HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗,之后進(jìn)行壓片.

1.2.4 免疫組織化學(xué)分析:對腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋后切片,分別采用二甲苯和無水乙醇脫石蠟和脫水,在枸櫞酸鈉溶液煮沸10 min介導(dǎo)抗原復(fù)性.之后分別采用3%過氧化氫和1%胎牛血清白蛋白封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性和非特異性位點(diǎn),采用PBS稀釋的一抗孵育,4 ℃過夜.PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗,每步均室溫孵育20 min,加入發(fā)光液后顯色.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.計(jì)量資料采用表示,干預(yù)組與對照組小鼠腫瘤重量及蛋白表達(dá)量均采用Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行分析.P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制腫瘤生長 在連續(xù)給藥20 d后處死裸鼠,剝離皮下腫瘤后進(jìn)行稱重,見圖1.姜黃素干預(yù)組裸鼠的瘤體平均質(zhì)量為(1.03±0.17)g,對照組裸鼠的瘤體平均質(zhì)量為(2.46±0.48)g,2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02).采用姜黃素干預(yù)后小鼠的腫瘤抑制率達(dá)58.13%.

圖1 2組小鼠成瘤情況

2.2 Western blot檢測結(jié)果 與對照組比,干預(yù)組裸鼠腫瘤組織p-Erk1/2蛋白相對表達(dá)量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Erk1/2、Akt及p-Akt蛋白相對表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2.

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果 對組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后,進(jìn)行拍照,對各組圖片進(jìn)行染色強(qiáng)度分析,每組選擇6張圖片,取平均值進(jìn)行比較,結(jié)果表明p-Akt染色強(qiáng)度在對照組與干預(yù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而干預(yù)組p-Erk1/2的表達(dá)量顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3.

3 討論

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是臨床上最常見的腫瘤性疾病之一,在所有成年人惡性腫瘤中占2%~3%[12].在美國每年約有3萬RCC新增病例[13].腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)是RCC最常見的亞型之一,占RCC患者總數(shù)的80%~90%[14].研究證實(shí)多種環(huán)境及遺傳因素與RCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15],但導(dǎo)致RCC原癌基因激活及腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制仍有待研究.

圖2 Western blot檢測2組裸鼠腫瘤組織Erk1/2、Akt磷酸化情況

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測2組裸鼠腫瘤組織p-Erk1/2、p-Akt表達(dá)(X400)

RCC常規(guī)治療方法包括化療、放療及激素療法,均會產(chǎn)生耐受.姜黃素是一種天然存在的抗腫瘤化合物,本課題組前期研究證實(shí)姜黃素在體外可以抑制腎癌細(xì)胞786-O的生存和增殖,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11].ZHANG等[16]研究也證實(shí)姜黃素可以調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯,進(jìn)而顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.本研究在此基礎(chǔ)上對姜黃素的體內(nèi)抗腫瘤效果進(jìn)行了評估,并初步探討了其作用機(jī)制,結(jié)果表明,通過腹腔注射50 mg/kg姜黃素連續(xù)治療20 d,裸鼠的腫瘤生長得到抑制,腫瘤的抑制率為58.13%.Western blot檢測Erk1/2及Akt信號通路蛋白結(jié)果表明,姜黃素通過抑制Erk1/2的磷酸化而非Akt的磷酸化從而抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的增殖,免疫組織化學(xué)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果.ZHANG等[16]的研究表明,Akt信號通路參與了姜黃素抑制腎細(xì)胞癌RCC-949的增殖,這與本研究結(jié)果不一致,出現(xiàn)這一情況的原因可能是RCC的發(fā)生機(jī)制較多,且采用不同的細(xì)胞系進(jìn)行研究也可能是導(dǎo)致結(jié)果不一致的主要原因.

綜上所述,姜黃素具有較好的抑制腫瘤生長的效果,通過抑制Erk1/2的磷酸化,進(jìn)而抑制人腎癌細(xì)胞786-O在裸鼠體內(nèi)增殖.

[1] 狄建彬, 顧振綸, 趙笑東, 等. 姜黃素的抗氧化和抗炎作用研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2010, 41(5): 854-859.

[2] 陳四梅, 張森凱, 劉網(wǎng)網(wǎng), 等. 姜黃素衍生物L(fēng)6H4對糖脂代謝異常大鼠的治療作用及其機(jī)制[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(3): 176-180.

[3] 姜程曦, 林良義, 宋嬌, 等. 姜黃素類似物抑制炎癥反應(yīng)緩解1型糖尿病腎損傷實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中草藥, 2015, 46(12):1785-1790.

[4] 吳杰, 徐嬌嬌, 葉娟, 等. 天然姜黃素類化合物抗人類呼吸道合胞病毒研究[J]. 中國藥師, 2015, 18(1): 34-37.

[5] 鄭丹, 韓文文, 洪廣亮, 等. 姜黃素對百草枯中毒大鼠急性腎氧化損傷的干預(yù)作用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 46(6): 391-396.

[6] 陳建平, 李琳, 蘇健裕. 姜黃素的抗氧化及抗腫瘤活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(12): 11-16.

[7] 林清認(rèn), 周霞. 姜黃素對肺癌細(xì)胞的放療增敏作用及機(jī)制研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2014, 34(5): 33-36.

[8] 郭立達(dá), 焦振霞, 宋瑛, 等. 姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(13):2191-2196.

[9] 盛琦, 陳建, 李菌. 姜黃素逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的研究[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2013, 30(4): 360-364.

[10] 楊芳, 趙秋, 王渝, 等. 姜黃素抑制STAT3信號通路對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響[J]. 世界華人消化雜志, 2011, 19(30):3149-3153.

[11] 趙建通, 張磊, 劉文瞻, 等. 姜黃素與索拉非尼聯(lián)合對人腎癌細(xì)胞株786-O增殖抑制作用的體外研究[J]. 河北醫(yī)藥,2016, 38(4): 495-501.

[12] 周海生, 張愛偉, 陳偉建, 等. MRI擴(kuò)散加權(quán)成像在乏脂肪腎血管平滑肌脂肪瘤和腎癌間的鑒別診斷價(jià)值[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 46(6): 447-450.

[13] 楊淑哲, 羅春麗, 吳小候, 等. hepaCAM和VEGF基因表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的探討[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2010, 16(1): 157-160.

[14] 史培堃, 曾貝妮, 吳偉芳, 等. Keap1在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其作用[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2017, 55(3): 94-99.

[15] 黃振, 荊濤, 駱磊, 劉勇. Xp11.2易位/TFE3基因融合相關(guān)性腎癌與腎透明細(xì)胞癌差異性分析[J]. 臨床泌尿外科雜志, 2017, 17(03): 196-201.

[16] ZHANG H, XU W, LI B, et al. Curcumin promotes cell cycle arrest and inhibits survival of human renal cancer cells by negative modulation of the PI3K/AKT signaling pathway[J]. Cell Biochem Biophys, 2015, 73(3): 681-686.

(本文編輯:趙翠翠)

Curcumin inhibits the proliferation of human renal cell carcinoma 786-O in nude mice via Erk1/2 signaling pathway

ZHAO Jiantong1, ZHANG Lei2, LIU Wenzhan1, XU Fei1, GUO Mingtao1, LU Zhimin1, XIAO Bo1.
1.Department of Urology, Handan First People's Hospital, Handan, 056000; 2.Institute of Foundation, Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050012

Objective:To investigate the inhibitory effect of curcumin on 786-O cells and explore the potential mechanisms.Methods:Nude mice were randomly divided into two groups. Human kidney cancer cells 786-O were inoculated in nude mice. Intervention group mice were treated with curcumin and the control group mice were treated with PBS. The inhibition rate of tumor in the intervention group was determined. p-Erk1/2 and p-Akt expression was detected using Western blot and immunohistochemistry.Results:The average weight of the tumor of nude mice was (1.03±0.17)g in the intervention group and (2.46±0.48)g in the control group, the difference was significant (P=0.02). The tumor inhibition rate of mice treated with curcumin was 58.13%. Western blot and immunohistochemical staining showed that the phosphorylation level of Erk1/2 in intervention group was significantly lower than that in the control group (P<0.01), no significantly difference was observed in the expression of Erk1/2, Akt and p-Akt in the two groups (P>0.05).Conclusion:The results of this study show that curcumin can inhibit the growth of tumor in vivo and inhibit the phosphorylation of Erk1/2 and inhibit the proliferation of human renal carcinoma cell line 786-O in nude mice.

curcumin; human renal carcinoma cell; Erk1/2; Akt; in vivo

R285.5;R692.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.007

2017-04-18

邯鄲市科技計(jì)劃項(xiàng)目(1423108063-10).

趙建通(1980-),男,河北邢臺人,主治醫(yī)師,碩士.

肖波,主任醫(yī)生,Email:819543118@qq.com.