杜勇,黃智銘,林秀清,陳新

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325015,1.兒科;2.消化內科)

肝癌小鼠模型中調節(jié)性T細胞對樹突狀細胞的作用

杜勇1,黃智銘2,林秀清2,陳新2

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325015,1.兒科;2.消化內科)

目的:構建BALB/c小鼠原位肝癌模型,分離腫瘤小鼠體內的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Tregs)和樹突狀細胞(DC),研究Tregs對DC功能的影響.方法:采用肝癌細胞懸液直接接種BALB/c小鼠肝臟建立原位肝癌模型.模型制作成功后25 d處死動物,無菌取出脾臟,用免疫磁珠分選法分離純化肝癌小鼠脾臟中的Tregs、CD4+CD25-效應T細胞和DC.Tregs和效應T細胞共培養(yǎng),CCK8法檢測Tregs對效應T細胞增殖情況的影響.DC和Tregs直接接觸共培養(yǎng),用流式細胞儀檢測DC表面協(xié)同刺激分子CD80/CD86表達的變化,ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12的分泌.結果:成功構建了小鼠原位肝癌模型,并分離出高純度的Tregs、效應T細胞和DC.Tregs在體外能抑制CD4+CD25-效應T細胞的增殖.DC和Tregs共培養(yǎng)時,Tregs會下調DC表面協(xié)同刺激分子CD80/CD86的表達,并抑制DC分泌IL-12和TNF-α.結論:肝癌小鼠模型中Tregs能抑制DC的功能,從而抑制機體的抗腫瘤免疫,針對Tregs進行腫瘤免疫治療是腫瘤治療的新策略.

肝腫瘤;CD4+CD25+調節(jié)性T細胞;樹突狀細胞;免疫抑制;小鼠

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,傳統(tǒng)的治療手段效果不佳,預后差.樹突狀細胞(dentritic cells,DC)疫苗可以有效地提呈腫瘤相關性抗原,激發(fā)宿主體內產生特異性抗腫瘤細胞的免疫,故成為近年來腫瘤治療的研究熱點[1].然而機體的腫瘤免疫抑制微環(huán)境與腫瘤免疫耐受及逃逸不利于免疫效應細胞發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫.CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Tregs)在肝癌患者外周血和腫瘤微環(huán)境中表達增加,可能與腫瘤免疫逃逸有關[2].為此,本研究通過建立小鼠原位肝癌模型,研究Tregs對DC功能的影響,探討腫瘤小鼠體內Tregs抑制抗腫瘤免疫反應的作用及機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物:6~8周齡的SPF級雄性BALB/C小鼠30只,體質量18~20 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,生產許可證號:SCXK(滬)2012-0002,飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級實驗室.所有動物實驗均獲本校倫理委員會及實驗動物委員會批準.

1.1.2 細胞株:鼠源性H22腹水型肝癌細胞株購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心.

1.1.3 主要試劑及儀器:FITC rat anti-mouse CD4及同型對照FITC rat IgG2b購自美國BD公司;FITC rat anti-mouse CD80及同型對照FITC rat IgG2b、PE rat anti-mouse CD86及同型對照PE rat IgG2b、PE rat anti-mouse CD25及同型對照PE rat IgG2b購自美國eBscience公司;小鼠CD4+CD25+T細胞磁珠分選試劑盒及小鼠CD11C免疫磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi公司;CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所;TNF-α、IL-12 ELISA試劑盒購自德國IBL公司;流式細胞儀購自美國BD公司;光學顯微鏡購自日本Nikon公司.

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備:小鼠原位肝癌模型建立的具體步驟參照張海英等[3]的造模法.從液氮中取出凍存的肝癌細胞,常規(guī)復蘇后,培養(yǎng)基調整細胞濃度為1X107個/mL,用1 mL BD注射器直接注入小鼠腹腔0.1 mL.8~9 d后無菌抽出癌性腹水,洗滌2次后計數(shù),調整細胞濃度為106個/mL,造模備用.4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(100 mg/μL),麻醉后,取仰臥位,四肢固定于手術臺上,備皮,酒精消毒后,于腹正中線劍突下作一長約0.8 cm的縱行切口,濕紗布墊于切口下方,輕壓雙側肋弓,擠出肝左葉,暴露肝臟,用1 mL BD注射器針頭與肝臟成30°角方向斜刺入肝實質后,緩慢注入10 μL肝癌細胞懸液(104個細胞);退出針頭,壓迫止血,輕輕將肝臟送回腹腔,依次縫合肌肉皮膚,關閉腹腔.術后繼續(xù)飼養(yǎng),自由飲水進食.

1.2.2 組織病理學檢查:25 d左右,肝癌小鼠模型建造成功.小鼠精神萎靡,活動遲緩,大量腹水形成.解剖時可見肝臟表面有灰白色,質偏硬,大小在0.5~1.0 cm范圍內的塊狀癌組織.取出癌組織,甲醇溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,在光學顯微鏡下行組織學觀察.

1.2.3 Tregs的免疫磁珠分選:無菌條件下取出肝癌小鼠脾臟,剪碎,用注射器針芯研磨脾組織后,通過200目鋼網過濾,收集流出的單細胞懸液,制備脾單個核細胞懸液.嚴格按照Miltenyi的Tregs分離說明書,經過陰性及陽性分選后,獲得純化的Tregs和CD4+CD25-效應T細胞.按照Miltenyi的DC分離說明書進行操作,從脾單個核細胞懸液中分離獲得DC.通過流式細胞儀檢測分選出的Tregs、CD4+CD25-效應T細胞和DC的純度.分別收集分選后的細胞,培養(yǎng)基洗滌,用于后續(xù)培養(yǎng).用臺盼藍檢測分選出的細胞的存活率,顯微鏡下觀察死亡細胞被染成明顯的藍色,活細胞拒染呈無色透明狀,計算分選出的活細胞率均大于95%.

1.2.4 CCK8檢測增殖抑制試驗:Tregs(2X104,8X104)和CD4+CD25-效應T細胞(8X104/孔)按1:4和1:1的比例混合培養(yǎng)在96孔板中,同時設對照組和空白孔,每組設5個復孔,每孔加0.5 μg ConA,至終濃度為2.5 μg/mL,用含血清和雙抗的培養(yǎng)基每孔補足至200 μL,放于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,結束前4 h每孔加10 μL CCK8,用酶標儀測570 nm處OD值.

1.2.5 Tregs和DC的共培養(yǎng):分選出的Tregs和DC(5X105)以0:1、1:1的比例直接接觸共培養(yǎng)24 h后,加入脂多糖至終濃度為1 μg/mL,并設相應的對照孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)后的細胞并分離DC,流式細胞儀檢測CD80/CD86的表達;ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12的表達.

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析.計量資料用表示.進行正態(tài)性檢驗,符合正態(tài)性分布,2組間比較用t檢驗;非正態(tài)分布的數(shù)據(jù),2組間比較用Mann-Whitney U檢驗.P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 肝癌荷瘤小鼠模型建立 解剖肝臟表面可見直徑0.5~1.0 cm大小的灰白色質地偏硬的癌組織包塊,癌組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色.光學顯微鏡下觀察到肝臟失去正常結構,壞死明顯,癌細胞呈多角形或圓形,排列成巢而無間質成分,排列紊亂,細胞大小不一,異形性明顯,見圖1.

2.2 Tregs和CD4+CD25-效應T細胞的分離結果 肝癌小鼠脾臟單個核細胞按照Miltenyi的Tregs分離說明書經過免疫磁珠陰性分選和陽性分選后,分別獲得Tregs和CD4+CD25-效應T細胞.肝癌小鼠脾臟單個核細胞按照Miltenyi的DC分離說明書進行操作,獲得DC.流式細胞儀檢測Tregs純度>90%,CD4+CD25-效應T細胞純度>90%,DC純度>90%;見圖2-4.

圖1 肝癌組織標本及病理學檢查結果

圖2 免疫磁珠分選后DC的純度

圖3 免疫磁珠分選后CD4+CD25-效應T細胞的純度

2.3 CCK8檢測Tregs抑制CD4+CD25-效應T細胞的增殖 當Tregs與CD4+CD25-效應T細胞比為1:4混合共培養(yǎng)時,抑制率為23.61%.當Tregs與CD4+CD25-效應T細胞比為1:1混合共培養(yǎng)時,抑制率為53.95%,CD4+CD25-效應T細胞孔OD值為(1.28±0.09),Tregs與CD4+CD25-效應T細胞比為1:1混合共培養(yǎng)時,OD值為(0.82±0.03),2組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.616,P<0.05).純化的Tregs對CD4+CD25-效應T細胞的增殖有明顯的抑制作用,見圖5.

圖4 免疫磁珠分選后Tregs的純度

圖5 Tregs和CD4+CD25-效應T細胞1:1共培養(yǎng)時,Tregs對CD4+CD25-效應T細胞增殖的影響

2.4 分選純化后的各組形態(tài)DC 分為3組,DC單獨培養(yǎng)(DC組);DC單獨培養(yǎng)經LPS刺激活化(DC+LPS組);DC與Tregs直接接觸共培養(yǎng)24 h后,再經LPS(1 μg/mL)刺激活化(DC+Tregs+LPS組).光學顯微鏡下DC和Tregs各細胞形態(tài),見圖6.

2.5 Tregs抑制DC表面協(xié)同刺激分子的表達及細胞因子的分泌 LPS刺激活化的DC表達高水平的協(xié)同刺激分子CD80/CD86,并分泌大量的免疫調節(jié)介質TNF-α和IL-12,當Tregs和DC共培養(yǎng)時,Tregs會抑制DC表面協(xié)同刺激分子的表達和細胞因子的分泌.當Tregs和DC以1:1比例直接接觸共培養(yǎng)后,共培養(yǎng)組DC表面CD80的表達明顯低于DC+LPS組中DC表面CD80的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(209.4±25.8 vs.859.4±47.0,t=27.104,P<0.05);共培養(yǎng)組DC表面CD86的表達明顯低于DC+LPS組中DC表面CD86的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(312.0±40.1 vs.1 083.4±68.6,t=21.707,P<0.05),見圖7.Treg和DC共培養(yǎng)組上清液中TNF-α的表達明顯低于DC+LPS組中TNF-α的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(275.4±19.7 vs. 578.0±49.2,t=12.781,P<0.05);共培養(yǎng)組上清液中IL-12的表達明顯低于DC+LPS組中IL-12的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(163.4±11.5 vs.411.2±29.1,t=17.686,P<0.05),見圖8.

圖6 光學顯微鏡下的DC和Tregs

圖7 流式細胞儀檢測DC細胞表面協(xié)同刺激分子CD80/CD86的表達

3 討論

Tregs在維持機體的免疫耐受中發(fā)揮重要的作用,能抑制CD4+Th細胞、CD8+細胞毒性T細胞、自然殺傷性細胞等免疫細胞的功能.近年來研究發(fā)現(xiàn),Tregs除了在自身免疫性疾病、哮喘、感染等方面發(fā)揮著作用,在腫瘤免疫方面也起著重要的作用,在胃癌、肝癌等多種腫瘤患者體內均有增多,其數(shù)量的增多預示癌癥患者的預后變差[4-5],而去除Tregs可以增強機體的抗腫瘤免疫[6]. 在肝癌小鼠模型中,靶向藥物索菲尼通過抑制Tregs的增殖和誘導其凋亡,從而產生有效的抗腫瘤免疫應答[7].在III期臨床試驗腫瘤患者中,通過ipilimumab單抗阻斷CTLA-4可達到治療效果[8].腫瘤免疫是以細胞免疫為主的免疫反應,腫瘤浸潤淋巴細胞是宿主抗腫瘤免疫反應的重要途徑之一.研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤微環(huán)境中雖然有大量的淋巴細胞浸潤,但廣泛的淋巴細胞浸潤并沒有控制腫瘤的發(fā)生及生長,提示腫瘤局部免疫監(jiān)視和控制的失敗.腫瘤細胞可以通過擴增或招募Tregs,抑制機體對腫瘤的免疫作用. Tregs可通過一系列的機制抑制機體的免疫功能,包括依賴抑制性細胞因子的途徑、溶解細胞的途徑、破壞細胞代謝的途徑和調節(jié)抗原提呈細胞功能的途徑[9-10].

圖8 Tregs和DC直接接觸共培養(yǎng)后上清液中TNF-α和IL-12的表達

DC是已知的體內抗原提呈功能最為強大的抗原呈遞細胞,是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁,在腫瘤免疫中起到十分重要的作用.在抗原提呈過程中,活化的DC會表達高水平的CD80/CD86,分泌大量的免疫調節(jié)介質TNF-α和IL-12來激活初始和記憶性T細胞,誘導抗原特異性CTL活化和增殖,從而殺傷腫瘤細胞.以DC為基礎制備的DC腫瘤疫苗,可誘發(fā)機體產生較強的抗腫瘤免疫應答能力,在臨床免疫治療試驗中顯示出一定的治療效果.但腫瘤患者體內常常存在DC數(shù)量的減少和功能的缺陷.在大鼠肝癌模型中,Tregs表達增高,而DC存在功能障礙.

本研究發(fā)現(xiàn)Treg和效應T細胞共培養(yǎng)時,Tregs能顯著抑制CD4+CD25-效應T細胞的增殖,且抑制率隨Tregs濃度的增大而增大.當Tregs與DC直接接觸共培養(yǎng)時,Tregs可通過下調DC表面的CD80/CD86協(xié)同刺激分子,降低抗原提呈細胞活化T細胞的能力,并通過抑制DC TNF-α和IL-12的分泌,抑制T細胞的活化.

[1] ANGUILLE S, SMITS E L, LION E, et al. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy[J]. Lancet Oncol, 2014,15(7): e257-e267.

[2] PEDROZA-GONZALEZ A, VERHOEF C, IJZERMANS J N, et al. Activated tumor infiltrating CD4+ regulatory T cells restrain antitumor immunity in patients with primary or metastatic liver cancer[J]. Hepatology, 2013, 57(1): 183-194.

[3] 張海英, 李艷茹, 王健君, 等. 小鼠原位移植性肝癌模型的建立及生物學特性[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2009, 35: 5-8.

[4] 蔣衛(wèi)平, 丁茂文, 朱亞非, 等. 實時熒光定量RT-PCR檢測人外周血單個核細胞中FOXP3 mRNA的表達[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2009, 39(6): 595-598.

[5] 陳壇辀, 金瑞放, 黃智銘, 等. CD4+CD25+Foxp3調節(jié)性T細胞在人幽門螺桿菌感染后胃黏膜中的表達[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2011, 41(2): 149-152.

[6] YANG P, LI Q J, FENG Y, et al. TGF-β-miR-34a-CCL22 signaling-induced Treg cell recruitment promotes venous metastases of HBV-positive hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell, 2012, 22(3): 291-303.

[7] CHEN M L, YAN B S, LU W C, et al. Sorafenib relieves cell-intrinsic and cell-extrinsic inhibitions of effector T cells in tumor microenvironment to augment antitumor immunity[J]. Int J Cancer, 2014, 134(2): 319-331.

[8] BLANK C U, ENK A. Therapeutic use of anti-CTLA-4 antibodies[J]. Int Immunol, 2015, 27(1): 3-10.

[9] YI Y, HE H W, WANG J X, et al. The functional impairment of HCC-infiltrating γδ T cells, partially mediated by regulatory T cells in a TGFβ- and IL-10-dependent manner[J]. J Hepatol, 2013, 58(5): 977-983.

[10] ROTHSTEIN D M, CAMIRAND G. New insights into the mechanisms of Treg function[J]. Curr Opin Organ Transplant, 2015, 20(4): 376-384.

(本文編輯:吳彬)

The influence of regulatory T cells on dendritic cells in mice with hepatocellular carcinoma

DU Yong1,HUANG Zhiming2, LIN Xiuqing2, CHEN Xin2.
1.Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Gastroenterology and Hepatology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate how CD4+CD25+regulatory T cells (Tregs)impacted on dendritic cells which were separated from BALB/c mice with hepatocellular carcinoma.Methods:BALB/c mice with hepatocellular carcinoma were established in laboratory. Twenty-five days after the models, the tumor-bearing mice were sacrificed and fresh spleen tissues were separated. Tregs, CD4+CD25-T cells and dendritic cells were separated from the mice's spleen and purified by immuno-magnetic beads according to the manufacturers' instructions. Tregs were co-cultured with CD4+CD25-T cells and the proliferation experiment was measured with CCK8. Tregs were directly co-cultured with dendritic cells and then the expression of CD80/CD86 on dendritic cells was detected by flow cytometry. The levels of TNF-α and IL-12 in supernatants were detected by ELISA.Results:We successfully established the tumor model of hepatocellular carcinoma and obtained high purity of Tregs, CD4+CD25-T cells and dendritic cells. Tregs could suppress the proliferation of CD4+CD25-T cells in vitro. Tregs could down-regulate the expression of CD80/CD86 on dendritic cells and inhibit the expression of TNF-α and IL-12.Conclusion:Tregs play an important role in the establishment and persistence of tumor immune suppression. Tregs can inhibit the function of dendritic cells in tumor-bearing mice. So Tregs may be a promising therapeutic target for cancer.

hepatocellular carcinoma; CD4+CD25+regulatory T cells; dendritic cells; immunosuppression;mice

R392

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.004

2017-03-14

浙江省自然科學基金資助項目(Y2090660).

杜勇(1986-),女,浙江溫州人,住院醫(yī)師,碩士.

黃智銘,主任醫(yī)師,Email:wfyhzm@163.com.