雷 洪，王可可，哈艷平，賈亞楠，李汝佳，申志華，郭峻莉，揭 偉

血清反應(yīng)因子全長及N端片段過表達慢病毒載體的構(gòu)建及其對心臟干細(xì)胞分化的影響

雷 洪1，王可可1，哈艷平1，賈亞楠2，李汝佳1，申志華2，郭峻莉3，揭 偉1

目的探討血清反應(yīng)因子全長(SRF-Full)及N端片段(SRF-N,1-254aa)對TGF-β1誘導(dǎo)c-Kit+心臟干細(xì)胞(cardiac stem cell, CSC)分化的影響。方法從cDNA文庫擴增大鼠SRF-Full及SRF-N表達序列并克隆入酶切線性化慢病毒載體GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞篩選出陽性克隆并測序鑒定。將SRF-Full及SRF-N過表達質(zhì)粒與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞HEK293T，包裝慢病毒。磁激活細(xì)胞分選法分離乳SD大鼠c-Kit+CSC，將SRF-Full及SRF-N過表達慢病毒感染CSC并經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)，定量PCR分析下游分化基因mRNA水平的變化。結(jié)果成功擴增出SRF-Full及SRF-N編碼序列并正確連接入線性化載體，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序無誤。將轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T后，獲得滴度為2×108TU/mL的慢病毒顆粒，Western blot檢測到預(yù)期Flag融合蛋白。重組慢病毒感染CSC后細(xì)胞核中見eGFP信號。TGF-β1誘導(dǎo)CSC出現(xiàn)心肌細(xì)胞分化基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌細(xì)胞分化基因(SM22α)的表達，內(nèi)皮細(xì)胞分化(vWF)無影響，SRF-Full促進CSC的心肌細(xì)胞分化，而SRF-N則抑制這種分化。結(jié)論成功構(gòu)建SRF-Full及SRF-N過表達重組慢病毒質(zhì)粒。SRF-Full促進而SRF-N減弱TGF-β1誘導(dǎo)CSC的心肌細(xì)胞分化。

血清反應(yīng)因子；血清反應(yīng)因子N端片段；質(zhì)粒構(gòu)建；心臟干細(xì)胞；細(xì)胞分化

干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病是當(dāng)前心臟再生醫(yī)學(xué)研究的重點與熱點之一。研究表明，干細(xì)胞參與受損心肌組織修復(fù)的機制主要是旁分泌而非直接的細(xì)胞分化[1-3]。影響干細(xì)胞分化的因子眾多。血清反應(yīng)因子(serum response factor, SRF)是一種高度保守且廣泛存在于多種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，屬于MADS轉(zhuǎn)錄因子家族，其通過結(jié)合CArG序列[CC(A/T)6GG]實現(xiàn)時空特異性調(diào)控超過200個下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，這些基因涉及細(xì)胞生長、遷移、骨架形成和成肌過程。在人類慢性心衰組織中SRF可被Caspase 3剪接成N片段(SRF-N, 1-254aa)及C片段(SRF-C, 255-508aa)[4-5]。由于N片段含有MADS結(jié)合域但不含有催化結(jié)構(gòu)域，因此，SRF-N可與SRF全長(SRF-Full)競爭性結(jié)合靶基因的CArG盒因而影響下游編碼心肌收縮等基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而惡化心功能。作者假設(shè)心肌梗死等損傷后局部移植干細(xì)胞中SRF很可能同樣被剪切而產(chǎn)生SRF-N片段，進而對移植的干細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生不利的影響。目前尚未見有關(guān)SRF-N與干細(xì)胞分化的報道。c-Kit+心臟干細(xì)胞(cardiac stem cell, CSC)是具有多向分化潛能的成體細(xì)胞，在心肌損傷再生研究中獲得較多的關(guān)注[6-8]。本文旨以轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)c-Kit+CSC分化為模型，分析SRF-N對TGF-β1信號誘導(dǎo)下c-Kit+CSC分化的影響，為推進干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株 乳SD大鼠c-Kit+CSC為原代分離。HEK293T細(xì)胞、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、慢病毒載體GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0及pHelper 2.0、陰性對照慢病毒均購自上海吉凱公司。

1.1.2主要試劑 cDNA文庫為上海吉凱公司產(chǎn)品；In-Fusio PCR Cloning試劑盒購自Clontech公司；Taq聚合酶購自SinoBio公司；dNTP、RT及Real-time PCR試劑盒為Takara公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司；Trizol、FBS、DMEM、Opti-MEM和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；PCR引物由上海生工公司合成；抗Flag一抗為Sigma產(chǎn)品，HRP標(biāo)記抗鼠二抗購自Santa Cruz公司；干細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自廣州賽業(yè)公司；重組大鼠TGF-β1為Proptech產(chǎn)品。

1.1.3實驗動物 出生72 h以內(nèi)的乳SD大鼠購自廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號SYXK(粵)2015-0147，有關(guān)動物實驗操作均符合相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2方法

1.2.1SRF-Full和SRF-N慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 人SRF-Full可被Caspase 3剪切成含1-254 aa的SRF-N及255-508 aa的SRF-C片段[4-5]，目前未見有關(guān)大鼠SRF剪切體的報道。根據(jù)大鼠及人類SRF蛋白一級結(jié)構(gòu)特征，實驗設(shè)想同樣于254aa處將大鼠SRF-Full剪切成2個片段。根據(jù)GeneBank中大鼠SRF(NM_001109302)的基因序列信息，采用PCR法從cDNA文庫調(diào)取SRF-Full及SRF-N端蛋白質(zhì)編碼序列。引物如下：SRF-Full序列，上游5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTACCGAGCCAAGCTG-3′，下游5′-TCCTTGTAGT CCATACCGGTTTCACTCTTGGTGCTGTGGGTG-3′，產(chǎn)物長度1 559 bp；SRF-N序列：上游5′-GAGGAT CCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTACCGAGCCAAGCTGGG-3′，5′-TCCTTGTAGTCCATACCTTCCCCACTGCTGTCAGATTCC-3′，產(chǎn)物長度806 bp。引物含交換配對堿基、酶切位點(加粗，斜體)和增強序列(下橫線)。慢病毒質(zhì)粒GV358經(jīng)AgeⅠ酶切后得到線性化片段，將線性化載體和目的基因(SRF-Full及SRF-N)按摩爾數(shù)比例為1 ∶2混合，25 ℃ 30 min進行交換反應(yīng)，形成帶有目的基因的重組慢病毒載體。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送Invitrogen公司進行測序鑒定，大量提取陽性克隆質(zhì)粒DNA備用。

1.2.2重組SRF-Full及SRF-N過表達慢病毒的包裝、純化及鑒定 參考文獻報道[9]進行操作，HEK293T細(xì)胞接種15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達70%～80%時用于轉(zhuǎn)染。將20 μg重組質(zhì)粒Ubi-SRF-Full-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin、Ubi-SRF-N-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin，15 μg輔助質(zhì)粒pHepler 1.0及10 μg pHepler 2.0與Opti-MEM混勻于同一試管，總體積為2.5 mL，室溫孵育5 min；將100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM混勻于另一試管，室溫下孵育5 min；將兩試管液體混合，室溫作用20 min后加入HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)8 h后棄去上清并更換新鮮完全培養(yǎng)液20 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，0.45 μm濾器得到粗提病毒液，將病毒粗提液轉(zhuǎn)移至過濾杯中，4 000g離心10～15 min后得到高滴度的慢病毒濃縮液，分裝后保存在-80 ℃。取一支病毒液，應(yīng)用ELISA檢測HIV-1 p24抗原法判斷其滴度。取另外一支病毒液，按MOI值20感染HEK293T細(xì)胞，48 h后提取總蛋白，采用Western blot法檢測SRF-3Flag融合蛋白的表達。

1.2.3CSC的分離、培養(yǎng)、鑒定、病毒感染及誘導(dǎo)分化 參考干細(xì)胞分選法[10-12]分離原代乳SD大鼠c-Kit+CSC。乳鼠心臟機械剪碎后經(jīng)胰酶及膠原酶多次消化成細(xì)胞懸液，血清終止消化，冷PBS洗滌細(xì)胞，800g離心10 min后棄上清，細(xì)胞沉渣用4 mL DMEM液混勻，加入抗c-Kit一抗(1 ∶250)及FBS(0.5%)，垂直混合儀室溫下以5 r/min緩慢混合40 min，800g離心10 min棄上清，PBS洗2遍，細(xì)胞用4 mL DMEM混懸，加入10 μL偶聯(lián)二抗的磁珠，垂直混合儀室溫下以5 r/min緩慢混合30 min，將細(xì)胞懸液過磁柱，c-Kit+細(xì)胞在磁場中被吸附，棄去液體，用干細(xì)胞專用培養(yǎng)基沖洗磁柱，洗脫的細(xì)胞即為c-Kit+CSC。CSC置于37 ℃ 5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液(培養(yǎng)液中含抑制細(xì)胞分化的白血病抑制因子)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測c-Kit+細(xì)胞純度。取狀態(tài)良好的CSC接種于6孔板中(2×104/mL)，24 h后細(xì)胞貼壁，狀態(tài)生長良好，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，以感染復(fù)數(shù)為100加入慢病毒顆粒和DMEM(1 mL)孵育，8～10 h后加1 mL完全培養(yǎng)液置于37 ℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后吸去含病毒的培養(yǎng)液，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后在熒光顯微鏡下觀察感染效果，以嘌呤霉素3 μg/mL進行篩選用于后續(xù)實驗。實驗分組：陰性對照慢病毒感染組(NC組)、全長SRF過表達慢病毒感染組(SRF-Full組)、SRF-N過表達慢病毒感染組(SRF-N組)。以終濃度10 ng/mL的外源性TGF-β1分別處理3組細(xì)胞，于第2、7天后提取總RNA。

1.2.4RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR 參考文獻報道[13]進行。Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA，取100 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照定量PCR試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)體系為20 μL，含SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 5 μL，上游及下游引物各1 μL，DEPC水3 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s共55個循環(huán)。采用2-ΔΔCt相對定量法，以β-actin為內(nèi)參照分析心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA水平的改變。PCR引物序列如下：Nkx2.5(NM_053651.1)：上游5′-CAGGTCTATGAGCTGGAGCG-3′，下游5′-TTACACTTGTAGCGGCGGTT-3′；Gata4(NM_144730)：上游5′-ATGGGTCCTCCATCCATCCA-3′，下游5′-GCTGTTCCAAGAGTCCTGCT-3′；cardiac Tropnin I3(cTnI, NM_017144.2)：上游5′-TATGACCTGCGTGGCAAGTT-3′，下游5′-GCCCTCAGGTCCAAGGATTC-3′；SM22α(NM_031549)：上游5′-CTGTAATGGCTTTGGGCAGT-3′，下游5′-CTCTTATGCTCCTGGGCTTTC-3′；vWF(NM_053889.1)：上游5′-ACTTCACCTTCAGTGGCATCT-3′，下游5′-AGACAGCATCAGGGTCATCAG-3′；β-actin(NM_031144)：上游5′-CCCATCTATGAGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。

1.2.5Western blot 提取SRF-Full、SRF-N及NC組病毒感染HEK293T 48 h后的總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，取30 μg蛋白用于SDS-PAGE。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后加入一抗(Flag，1 ∶3 000；GAPDH，1 ∶3 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，羊抗小鼠HRP標(biāo)記IgG二抗(1 ∶4 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光后獲得目的蛋白條帶，膠片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照。

2 結(jié)果

2.1重組SRF-Full及SRF-N過表達慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定從cDNA文庫成功獲得SRF-Full及SRF-N蛋白編碼序列，大小與預(yù)期結(jié)果一致。通過序列交換法，將此序列克隆入經(jīng)Age I酶切后線性化慢病毒質(zhì)粒GV358，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞獲得陽性克隆，挑選陽性克隆經(jīng)測序證實序列無誤(圖1)，提示重組慢病毒質(zhì)粒Ubi-SRF-Full-3FLAG- SV40-EGFP-IRES-puromycin及Ubi-SRF-N-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin構(gòu)建成功，大量提取質(zhì)粒備用。

圖1 重組SRF-Full和SRF-N過表達慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

A.從cDNA文庫中調(diào)取SRF-Full蛋白質(zhì)編碼序列PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，1.DNA Marker，2.SRF-Full cDNA產(chǎn)物，長度為1 559 bp；B.重組SRF-Full過表達慢病毒質(zhì)陽性克隆部分測序結(jié)果；C.從cDNA文庫中調(diào)取SRF-N蛋白質(zhì)編碼序列PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，1.DNA Marker，2.SRF-N cDNA產(chǎn)物，長度為806 bp；D.重組SRF-N過表達慢病毒質(zhì)陽性克隆部分測序結(jié)果

2.2SRF-Full及SRF-N過表達慢病毒顆粒的包裝、擴增及鑒定分別將Ubi-SRF-Full-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin及Ubi-SRF-N-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin、pHelper1.0和pHelper2.0三個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在輔助質(zhì)粒的支持下，成功獲得重組SRF-Full及SRF-N過表達慢病毒，ELISA法測得病毒滴度均為2×108TU/mL。提取慢病毒感染HEK293T細(xì)胞總蛋白后，成功應(yīng)用Western blot法從RIPA裂解產(chǎn)物中檢測到SRF-Full-3Flag及SRF-N-3Flag融合蛋白的表達，蛋白大小與預(yù)期結(jié)果一致。同時，慢病毒感染HEK293T后在熒光顯微鏡下觀察到eGFP產(chǎn)生的綠色熒光信號(圖2)。上述結(jié)果提示本實驗成功獲得高滴度的SRF-Full及SRF-N過表達重組慢病毒。

2.3c-Kit+CSC的分選、鑒定及重組慢病毒感染采用文獻報道[10-12]的磁激活細(xì)胞分選法成功分選出c-Kit+CSC。剛分選的CSC胞體較小，呈圓形，部分細(xì)胞上附有磁珠，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁生長，逐漸變成梭形，約7天有克隆形成，細(xì)胞呈漩渦狀生長，21天時生長匯合，細(xì)胞呈纖維狀。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測純化分選2次后c-Kit+細(xì)胞純度超過95%(圖3)。后續(xù)試驗均以純化2次傳代5次的細(xì)胞進行。CSC接種6孔板24 h后貼壁，按照感染復(fù)數(shù)指數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為100加入重組SRF-Full、SRF-N過表達及NC對照慢病毒，24 h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，72 h后熒光顯微鏡下觀察到CSC中有明顯的胞核綠色熒光信號，提示SRF-Full及SRF-N過表達慢病毒成功進入細(xì)胞(圖4)。

圖2 重組慢病毒鑒定

A.Western blot法檢測SRF-Full-3Flag融合蛋白表達；1.陽性對照(Survivin-3FLAG-GFP)；2.陰性對照HEK293T；3.SRF-Full-3Flag；B.SRF-Full過表達慢病毒感染HEK293T 96 h(明視野)；C.SRF-Full過表達慢病毒感染HEK293T 96 h(熒光視野)；D.Western blot法檢測SRF-N-3Flag融合蛋白表達；1.陽性對照(Survivin-3FLAG-GFP；2.陰性對照HEK293T；3.SRF-N-3Flag；E.SRF-N過表達慢病毒感染HEK293T 96 h(明視野)；F.SRF-N過表達慢病毒感染HEK293T 96 h(熒光視野)

圖3 CSC形態(tài)及純度

A.CSC低倍視野；B.CSC高倍視野；C.IgG對照流式結(jié)果；D.純化2次CSC中c-Kit流式結(jié)果

圖4 重組慢病毒感染乳鼠c-Kit+CSC 72 h后熒光效果

2.4TGF-β1信號對c-Kit+CSC分化的影響c-Kit+CSC接種6孔板后給予10 ng/mL外源性TGF-β1誘導(dǎo)分化，于誘導(dǎo)第2、7天收獲細(xì)胞，定量PCR檢測心肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌細(xì)胞分化基因(SM22α)和內(nèi)皮細(xì)胞分化(vWF)mRNA水平的改變。結(jié)果顯示TGF-β1信號有效上調(diào)Nkx2.5、Gata4、cTnI及SM22α mRNA的水平，而對vWF mRNA無明顯誘導(dǎo)作用(圖5)。

圖5 TGF-β1信號對c-Kit+CSC分化的影響*P<0.05；N.S表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義

2.5SRF-Full及SRF-N過表達對TGF-β1信號誘導(dǎo)c-Kit+CSC分化的影響分別用SRF-Full組、SRF-N組和NC組按MOI值100感染CSC，7天后定量PCR檢測TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞標(biāo)志基因(TGF-β1對CSC內(nèi)皮細(xì)胞分化無明顯作用)mRNA水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，SRF-Full處理7天后心肌細(xì)胞早期分化標(biāo)志基因Nkx2.5和Gata4 mRNA水平上升明顯，晚期分化標(biāo)記基因cTnI未見明顯上升，平滑肌分化標(biāo)志基因SM22α mRNA明顯上升(圖6)。

圖6 SRF-Full及SRF-N過表達對TGF-β1信號誘導(dǎo)c-Kit+CSC分化的影響

A.Nkx2.5 mRNA；B.Gata4 mRNA；C.cTnI mRNA；D.SM22α mRNA；*P<0.05；**P<0.001；***P<0.001

3 討論

SRF表達異常與人類某些疾病的病理生理過程關(guān)系密切，如腫瘤、纖維化、神經(jīng)損傷再生及心功能衰竭等[14]。動物實驗表明，過表達SRF可誘導(dǎo)肥厚性心肌病，而基因敲除SRF可導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形，表現(xiàn)為小梁形成障礙、心壁變薄和心腔擴張[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠相對年輕大鼠其急性心肌梗死后心臟中SRF升高趨勢減弱，提示老年心臟對急性應(yīng)急的反應(yīng)欠佳[17]。Chang等[5]報道，人類慢性心衰心臟組織中SRF-Full可被Caspase 3剪切成SRF-N和SRF-C，SRF-N具有DNA結(jié)合序列但失去調(diào)控序列因而可與全長SRF競爭性調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，如抑制心肌細(xì)胞α-肌動蛋白的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致心肌收縮力減弱，最終形成心力衰竭。上述動物水平及臨床前研究結(jié)果提示，維持合適的SRF表達及活性對心臟發(fā)育、自穩(wěn)及心功能的保持至關(guān)重要。

干細(xì)胞移植治療心肌梗死的理想結(jié)果是移植的干細(xì)胞能通過有效分化來替代、補充受損的心肌組織、改善心功能。心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞眾多的分化標(biāo)志基因其DNA序列均具有特殊的CArG盒元件，SRF通過與CArG序列結(jié)合，與其他輔助因子一起構(gòu)成三元復(fù)合物，精細(xì)地調(diào)控分化基因的表達。因此，SRF對心肌梗死后移植干細(xì)胞的生物學(xué)功能至關(guān)重要。已經(jīng)證實，基因敲除SRF后對胚胎干細(xì)胞成肌分化影響顯著[18]。本課題組前期實驗初步證實，與常氧培養(yǎng)為對照，乳大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)低氧刺激后總SRF表達水平減弱，但小片段的剪切片段卻增加明顯(未發(fā)表資料)，目前對這些剪切片段的生物學(xué)功能尚不清楚。鑒于大鼠和人SRF蛋白同源性極大，本組實驗參考Chang等[5]的報道，將1-254 aa認(rèn)為是SRF-N，該氨基酸序列具有保守的MADS序列，因而具備DNA結(jié)合能力。為此，本組實驗首先利用cDNA文庫，應(yīng)用PCR調(diào)取了SRF-Full和SRF-N的編碼序列，將其分別克隆入慢病毒載體GV358，構(gòu)建和篩選SRF-Full及SRF-N的過表達慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)過有效的包裝，獲得高滴度的過表達慢病毒顆粒。進一步鑒定結(jié)果證實所包裝的慢病毒能表達Flag融合蛋白，可高效感染工具細(xì)胞。因此，SRF-Full和SRF-N過表達慢病毒的有效包裝及感染驗證，為后續(xù)干細(xì)胞中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

c-Kit+CSC是心臟固有成體干細(xì)胞中最常見的一種類型，在較多的臨床前研究及部分Ⅰ期臨床研究中得到重視[6]?？紤]到從幼年個體中分離的CSC較成年個體中CSC具有更高的細(xì)胞活性[19]，因而本實驗應(yīng)用成熟的MACS法從乳SD大鼠心臟組織中提取c-Kit+CSC，經(jīng)2次純化后其純度為95%以上。在外源性TGF-β1誘導(dǎo)下，7天后心肌細(xì)胞分化標(biāo)記基因Nkx2.5、Gata4和cTnI，平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因SM22α的轉(zhuǎn)錄水平明顯增強，而內(nèi)皮細(xì)胞分化相關(guān)基因vWF轉(zhuǎn)錄本卻未見明顯增加，提示c-Kit+CSC是多能干細(xì)胞，在TGF-β1誘導(dǎo)下主要向心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化為主。隨后，以MOI值為100將相應(yīng)SRF-Full及SRF-N慢病毒感染CSC，熒光顯微鏡下觀察到明顯的胞核定位，這與SRF的核轉(zhuǎn)錄因子的本質(zhì)相吻合。本組實驗選擇病毒感染后7天為觀察點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照病毒感染相比，過表達SRF-Full可明顯促進外源性TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分化，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞早期分化標(biāo)志基因Nkx2.5和Gata4轉(zhuǎn)錄水平的增加，而晚期分化標(biāo)志基因cTnI及平滑肌分化標(biāo)記基因SM22α的轉(zhuǎn)錄水平未見增加；相反，SRF-N在一定程度上減弱了TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分化。由此可見，SRF-N具有拮抗干細(xì)胞成肌分化的作用。

考慮到人類慢性心衰心臟組織中SRF-N水平增加的事實，很可能心肌梗死或心衰患者其心臟組織中移植的干細(xì)胞由于SRF-N的存在干擾了移植干細(xì)胞的成肌分化，從而不利于移植干細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮，今后我們將從體內(nèi)研究來進一步驗證這一假設(shè)。發(fā)現(xiàn)心肌梗死后有利或不利于移植干細(xì)胞生物學(xué)功能的因素并“揚長避短”，無疑對干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病具有重要的臨床意義?？傊?，本組實驗首次從體外實驗角度證實SRF-N具有抑制CSC成肌分化的作用，為推進今后基于CSC移植治療心肌梗死的臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供新思路。

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ConstructionofthefulllengthandN-terminalfragmentofserumresponsefactorover-expressinglentiviralplasmidanditsimpactsoncardiacstemcelldifferentiation

LEI Hong1, WANG Ke-ke1, HA Yan-ping1, JIA Ya-nan2, LI Ru-jia1, SHEN Zhi-hua2, GUO Jun-li3, JIE Wei1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicineSciences,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;3CardiovascularInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570102,China)

PurposeTo analyze the effects of full length and N-terminal fragment of serum response factor (SRF-Full and SRF-N) on TGF-β1-induced differentiation in c-Kit+ cardiac stem cells (CSC).MethodsRat SRF-Full and SRF-N (1-254 aa) coding sequences were obtained from cDNA library and cloned into the linearized lentviral vector GV358 (Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin) to generate the recombinant vectors, and then positive clones were selected and sequenced after transducing the competent cells with recombinant vectors. The recombinant lentvirus were packaged through transfecting the HEK293T cells with SRF-Full, SRF-N overexpressing plasmids and viral packaging plasmids. Neonatal SD rat c-Kit+ CSCs were isolated via magnetic activated cell sorting, and TGF-β1-induced differentiation in SRF-Full and SRF-N overexpression virus-infected CSCs was assessed by quantitative PCR.ResultsSRF-Full and SRF-N coding sequences were successfully obtained and properly cloned into the linearized GV358. The positive clones were selected and further confirmed by sequencing. With the help of packaging plasmids, the SRF-Full and SRF-N overexpressing plasmids-transfected HEK293T cells successfully produced the lentiviral particles with the titer of 2×108TU/mL, and the SRF-Full-Flag and SRF-N-Flag fusion protein were detected by Western blot in virus-infected HEK293T cells. Addition of TGF-β1 significantly induced up-regulated mRNAs in cardiomyocyte markers (Nkx2.5, Gata4, cTnI) and smooth muscle cell marker (SM22α) but not the epithelia cell marker (vWF) in CSCs. Overexpression of SRF-Full facilitated TGF-β1-triggered cardiomyocyte differentiation. However, SRF-N exerted anti-differentiation effects in TGF-β1-treated cells.ConclusionThe SRF-Full and SRF-N overexpressing recombinant lentiviral vectors are successfully constructed. SRF-Full facilitates while SRF-N suppresses TGF-β1-induced cardiomyocyte differentiation in c-Kit+ CSCs.

serum response factor; N-terminal fragment of serum response factor; plasmid construction; cardiac stem cell; cell differentiation

Q 21

A

1001-7399(2017)10-1109-07

時間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.011.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.011

接受日期：2017-06-21

國家自然科學(xué)基金(81460042)、廣東省教育廳科技創(chuàng)新項目基金(KJCX20130088)、廣東省“揚帆計劃”高層次人才項目(4YF16007G)、2015年國家留學(xué)人員科技活動擇優(yōu)資助項目

1廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系、2病理生理學(xué)教研室，湛江 524023

3海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管研究所，?？?570102

雷 洪，女，碩士研究生。E-mail: 511622913@qq.com

揭 偉，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。Tel: (0759)2388584，E-mail: wei.jie@gdmc.edu.cn