樊曉璐，張葦莉，吳幼茹，鄒 毅，李 楠

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004； 2.廣西大學(xué)糖業(yè)工程研究中心，廣西南寧530004)

丁酸梭菌的分離、鑒定與基本特性研究

樊曉璐1，張葦莉1，吳幼茹1，鄒 毅2，李 楠1

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004； 2.廣西大學(xué)糖業(yè)工程研究中心，廣西南寧530004)

通過厭氧培養(yǎng)法從朗姆酒發(fā)酵過程添加的丹多液中分離得到9株純菌株，經(jīng)過生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定出1株丁酸梭菌Y-1。研究了Y-1的基本生長(zhǎng)特性和安全性，結(jié)果表明，其具有較強(qiáng)的耐酸和耐酒精以及產(chǎn)酸能力，發(fā)現(xiàn)菌株在梭菌增殖培養(yǎng)液中最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.0，菌株對(duì)于酒精的最高耐受能力為9%vol，耐酸能力最低pH值為4.0。丁酸梭菌作為功能微生物在朗姆酒發(fā)酵過程中對(duì)香氣及風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用。

朗姆酒； 丹多液； 丁酸梭菌； 分離； 鑒定

丁酸梭菌(Clostridium butyricum),屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae），梭菌屬（Clostridium）[1]，有芽孢，革蘭氏陽(yáng)性菌，在老培養(yǎng)物中或可變?yōu)楦锾m氏陰性菌，是一種嚴(yán)格厭氧菌[2-3]。丁酸梭菌屬于腸道益生菌，對(duì)于體內(nèi)的致病菌有一定的抑制作用，同時(shí)可以促進(jìn)益生菌的增殖[4]。丁酸梭菌可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、酯酶、纖維素酶、半纖維素酶等多種胞外酶，并且能夠合成葉酸、煙酸、泛酸、維生素B1、毗哆醇、核黃素等維生素類化合物，主要代謝產(chǎn)物為丁酸、乙酸[5]。該菌主要從奶酪、酸奶、動(dòng)物和人的腸道以及土壤樹葉等自然環(huán)境中分離提取[6]。

朗姆酒是以甘蔗汁或甘蔗糖蜜為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的蒸餾酒，主要采用甘蔗汁與酵母菌發(fā)酵后加入產(chǎn)短鏈脂肪酸菌的丹多液（Dunder)共發(fā)酵[7]，丹多液（Dunder)其實(shí)是一類耐高酒精度和能利用甘蔗糖的多種微生物菌種構(gòu)成，通過共發(fā)酵生產(chǎn)得到朗姆酒中香味濃郁的風(fēng)味物質(zhì)[8]。丹多液內(nèi)含有眾多對(duì)朗姆酒發(fā)酵有益的微生物，尤其是丁酸梭菌對(duì)朗姆酒風(fēng)味的形成具有重要作用[9]。在朗姆酒香氣形成方面，丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物丁酸和乙酸可以與乙醇反應(yīng)生成丁酸乙酯和乙酸乙酯，對(duì)于朗姆酒特殊香氣的形成具有重要作用[10]。然而從自然環(huán)境中得到的發(fā)酵底液的丁酸梭菌含量微乎其微，因此從丹多液中篩選出1株丁酸梭菌，并將其增殖培養(yǎng)，后再以一定比例添加到發(fā)酵底液中進(jìn)行研究[11]。本研究以廣西海酩威釀酒股份有限公司生產(chǎn)朗姆酒所用的丹多液為篩選材料，從中篩選出對(duì)朗姆酒香氣形成有利的丁酸梭菌純菌株，為朗姆酒的香氣研究提供重要的菌種資源，也為朗姆酒風(fēng)味物質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

丹多液，廣西海酩威釀酒股份有限公司；PL303電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Julabo TW12恒溫水浴鍋，優(yōu)萊博技術(shù)有限公司；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機(jī)有限公司；UV min-1240島津紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；c-11厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；c-22氧氣指示劑，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；c-43圓底立式培養(yǎng)袋，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社。

1.1.2 培養(yǎng)基

厭氧完全培養(yǎng)基：大豆胨3 g、蛋白胨10 g、消化血清粉13.5 g、酵母浸膏5 g、牛肉膏2.2 g、牛肝膏（粉)1.2 g、葡萄糖3 g、KH2PO42.5 g、可溶性淀粉5 g、L-半胱氨酸鹽0.3 g、硫乙醇酸鈉0.3 g、肉湯（牛心湯）1000 mL，調(diào)pH7.2～7.4，115 ℃滅菌15 min。

梭菌增殖培養(yǎng)基：酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨l0 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.6 g、0.5%美藍(lán)0.2 mL、瓊脂1.5 g(固體培養(yǎng)基時(shí)用)、蒸餾水1000 mL；調(diào)節(jié)pH7.0～7.4，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酸指示培養(yǎng)基、明膠液化試驗(yàn)、麥芽糖分解、淀粉水解試驗(yàn)和牛乳試驗(yàn)培養(yǎng)基參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富集培養(yǎng)[14]

取丹多液1 mL加入至含20 mL已滅菌的厭氧完全培養(yǎng)液的試管中，80℃水浴處理10 min后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。后再將培養(yǎng)液于80℃中水浴處理10 min，然后以10%（v/v）的添加量將培養(yǎng)液接入到新的已滅菌的含厭氧完全培養(yǎng)液的試管中進(jìn)行富集培養(yǎng)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，如此反復(fù)熱處理和富集培養(yǎng)3次，選取產(chǎn)氣旺盛的試管進(jìn)行稀釋分離。

1.2.2 稀釋分離

取富集培養(yǎng)后的樣品10 mL加入到90 mL的無(wú)菌水中，80℃水浴10 min，殺死非芽孢菌，得到10-1稀釋度的樣品溶液，后再將樣品稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度，取各稀釋度的樣品0.2 mL涂布于厭氧完全培養(yǎng)基平板上，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，將平板置于含厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)袋中，37℃培養(yǎng)3 d。

將分離得到的菌種在厭氧完全培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線培養(yǎng)3～5次，得到菌種純菌落，用于菌種鑒定。

1.2.3 菌種鑒定[15]

初步鑒定：將菌種進(jìn)行影印好氧和厭氧培養(yǎng)，去除好氧菌和兼性厭氧菌，得到厭氧菌。選取培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和丁酸梭菌相似的細(xì)菌進(jìn)行明膠液化、牛乳、糖發(fā)酵等生理生化鑒定。

對(duì)疑似菌種進(jìn)行產(chǎn)酸和最大活菌量試驗(yàn)：在接種量5%（v/v），裝液量80%（v/v）的條件下，將菌種接入到含有梭菌增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，深層厭氧培養(yǎng)不同時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)記錄指示劑變化時(shí)間，并在培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)算產(chǎn)酸量和OD600值。

對(duì)篩選得到的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定：首先參照上海捷瑞生物工程有限公司生產(chǎn)的離心柱型細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取目標(biāo)菌株的DNA；后對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，采用通用引物（27F：5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR的反應(yīng)體系為：基因組DNA 0.5 μL，10XEasy TagBuffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA Ploymerase 0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水19.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（150 V，20 min），進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化；測(cè)序比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析即將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，后登錄NCBI（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用BLAST將16S rDNA測(cè)序結(jié)果與Genbank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，查找相似度最高的菌株，確定菌株所在屬，為了進(jìn)一步確定菌株的進(jìn)化地位，選取同屬親緣關(guān)系較近的模式菌株，用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 丁酸梭菌的生長(zhǎng)特性測(cè)定

1.3.1 丁酸梭菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

取15支含有梭菌增殖培養(yǎng)基的試管，以5%（v/v）的接種量、80%（v/v）的裝液量將種子液接種到培養(yǎng)管中，調(diào)節(jié)溫度至27℃、32℃、37℃、42℃、47℃，于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，并保持pH7.0，測(cè)定菌液的OD600值，每組3個(gè)平行。

1.3.2 丁酸梭菌最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定

取15支含有梭菌增殖培養(yǎng)基的試管，以5%(v/v)的接種量、80%(v/v)的裝液量將種子液接種到培養(yǎng)管中，用0.1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，16 h后測(cè)定菌液的OD600值，每組3個(gè)平行。

1.3.3 丁酸梭菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在最適培養(yǎng)條件下，以5%(v/v)的接種量、80%(v/v)的裝液量，將丁酸梭菌種子液接種到含有梭菌增殖培養(yǎng)基的試管中，每隔2 h取出1組，測(cè)定其OD600值，得到菌種的生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)中每組為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[16]。

1.3.4 丁酸梭菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)酸量的測(cè)定

在最適培養(yǎng)條件下，即培養(yǎng)溫度為37℃，初始pH7的培養(yǎng)條件下，以5%的接種量、80%的裝液量，將丁酸梭菌種子培養(yǎng)液接種到含有梭菌增殖培養(yǎng)基的試管中，每隔2 h取出1組，測(cè)定菌液中總酸含量，每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，完成菌種培養(yǎng)過程中產(chǎn)酸量的測(cè)定[17]。

1.3.5 丁酸梭菌的耐性實(shí)驗(yàn)測(cè)試

丁酸梭菌的耐酒精性能試驗(yàn)：取梭菌增殖培養(yǎng)基，按表1用95%vol的食用酒精調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中乙醇濃度分別為3%vol、5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol、15%vol，以10%（v/v）的接種量、80%（v/v）的裝液量將種子液接入含不同酒精含量的培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH7.0，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，測(cè)定菌液的OD600值[18]。通過計(jì)算最終以丁酸細(xì)胞濃度確定丁酸菌的耐酒精性能。

表1 耐酒精度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液配比

丁酸梭菌的耐酸性能試驗(yàn)：取丁酸菌種子培養(yǎng)基，用食用級(jí)丁酸調(diào)節(jié)pH值分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，以 80%（v/v）的裝液量裝入培養(yǎng)管中，按體積分?jǐn)?shù)10%（v/v）的菌種量接入不同pH值的培養(yǎng)液中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，測(cè)定其OD600值。通過最終的丁酸細(xì)胞濃度確定丁酸梭菌的耐酸性能[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離與鑒定

2.1.1 菌體個(gè)體和菌落特征鑒定

實(shí)驗(yàn)先將丹多液進(jìn)行富集培養(yǎng)，后通過稀釋涂布平板法在含有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)袋中分離培養(yǎng)，菌種經(jīng)過純化后，共得到9種菌株的單菌落。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，丁酸梭狀芽孢桿菌為嚴(yán)格厭氧菌，菌株在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)酸產(chǎn)氣，內(nèi)生孢子為卵圓形到球形，偏心或次端生。9種菌株經(jīng)過影印平板進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，后通過顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)并結(jié)合丁酸梭菌的特征進(jìn)行比對(duì)，可以發(fā)現(xiàn)有5株菌株符合條件，后對(duì)這5株符合群特征的菌株進(jìn)行群內(nèi)的生化鑒定（菌種的個(gè)體特征見表2，菌落形態(tài)見表3）。

2.1.2 分離菌株的生理生化鑒定

對(duì)符合群特征的Y-1、S-2、Z-1、Y-2、Y-3 共5株菌株進(jìn)行進(jìn)一步的生理生化鑒定，鑒定結(jié)果見表4。發(fā)現(xiàn)菌株Y-1和Z-1為丁酸梭狀芽孢桿菌。

表2 菌種個(gè)體特征

表3 菌株菌落形態(tài)

表4 菌株生理生化特征

2.1.3 菌種的產(chǎn)酸及最大活菌量實(shí)驗(yàn)

將得到的2株丁酸梭菌進(jìn)行產(chǎn)酸和最大活菌量實(shí)驗(yàn)，以菌株的最大產(chǎn)酸量和最大細(xì)胞濃度值OD600為結(jié)果[20]，篩選得到1株優(yōu)選菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5可以看出，Y-1菌株有著較好的產(chǎn)酸能力和較高的細(xì)胞濃度，因此，選擇Y-1（圖1）菌株為優(yōu)選菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表5 菌株最大產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

圖1 Y-1菌落形態(tài)

2.1.4 丁酸梭菌Y-1菌種的16S rDNA序列分析鑒定

16S rDNA PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)合格后，送至上海生工測(cè)序，獲得了測(cè)序結(jié)果。結(jié)果表明，Y-1菌株的16S rDNA的序列為1307 bp。利用BLAST對(duì)獲得的測(cè)序結(jié)果與Genbank中已有序列進(jìn)行比對(duì)，查找相似度最高的序列，是一株序列號(hào)為CP016332.1的梭菌屬菌株，相似性為100%；為進(jìn)一步確定菌株的遺傳關(guān)系和進(jìn)化方向，利用MEGA 5.1軟件對(duì)菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），由圖2可知，Y-1與菌種號(hào)為ATCC19398的Clostridium butyricum標(biāo)準(zhǔn)菌株親緣關(guān)系最近，與其在同一個(gè)分支，結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)和生理生化關(guān)系可以確定Y-1菌株為丁酸梭狀芽孢桿菌。

圖2 菌株Y-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 丁酸梭菌的生長(zhǎng)特性測(cè)定

2.2.1 丁酸梭菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定（圖3）

圖3 溫度對(duì)丁酸梭菌菌濃的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，菌濃呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度到達(dá)37℃時(shí)，菌體濃度達(dá)到最高值。故菌株Y-1的最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

2.2.2 丁酸梭菌最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定（圖4）

圖4 pH值對(duì)丁酸梭菌菌濃的影響

由圖4可知，菌體濃度隨pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)pH7～8時(shí)，菌體濃度達(dá)到最大，pH7時(shí)，菌體濃度最高；當(dāng)pH9時(shí)，試管內(nèi)菌體濃度基本已無(wú)任何變化，pH5時(shí)菌體濃度已明顯下降，可見，菌體在過酸或過堿的環(huán)境中均不能正常生長(zhǎng)?？赡苁怯捎诰w在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生一定量的酸，故中性或微堿性環(huán)境更適合菌體生長(zhǎng)。

2.2.3 丁酸梭菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（圖5）

由圖5可知，在最適溫度和最適pH值條件下，菌株Y-1在梭菌增殖培養(yǎng)中，在接種初期0～5 h，為菌株生長(zhǎng)延遲期，這一階段丁酸梭菌的生長(zhǎng)速率基本為0；在5 h或6 h時(shí)菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這一時(shí)期，細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛、大量繁殖，菌體數(shù)目成指數(shù)式增加；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約維持14 h，在20 h時(shí)數(shù)目基本不再變化，維持穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。

2.2.4 丁酸梭菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)酸量的測(cè)定（圖6）

圖5 丁酸梭菌生長(zhǎng)曲線

圖6 不同生長(zhǎng)時(shí)間菌液中總酸的變化情況

由圖6可知，丁酸梭菌的產(chǎn)酸量和丁酸梭菌的生長(zhǎng)是成正比的。當(dāng)菌體濃度升高時(shí)，菌體產(chǎn)酸量也隨之增加，同菌體生長(zhǎng)曲線一樣，菌體的產(chǎn)酸量同樣符合“S”型曲線，在0～5 h，菌體處于延遲期，菌液中總酸含量基本沒有任何變化；在6～20 h，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體濃度成指數(shù)式增加，菌液中總酸含量也成指數(shù)式增加；在20 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌濃基本保持不變，菌液中的總酸也基本達(dá)到最高值，菌液中總酸含量基本保持不變。

2.2.5 丁酸梭菌的抗性實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.2.5.1 丁酸梭菌的耐酒精性能試驗(yàn)（圖7）

從丁酸梭菌濃度可以確定菌株的耐乙醇特性，由圖7可以看出，隨著起始乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，培養(yǎng)液中丁酸梭菌的細(xì)菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。起始乙醇濃度為1%vol～3%vol之間時(shí)，對(duì)丁酸梭菌的生長(zhǎng)影響不大，丁酸梭菌均可正常生長(zhǎng)；當(dāng)乙醇濃度在5%vol時(shí)，丁酸梭菌的生長(zhǎng)量明顯降低，培養(yǎng)液中丁酸梭菌含量約降低50%。當(dāng)乙醇濃度超過9%vol以后，菌體基本停止生長(zhǎng)，表明9%vol以上的乙醇濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。因此，可以確定丁酸梭菌能夠耐受的乙醇濃度為9%vol。

圖7 丁酸梭菌Y-1對(duì)酒精的耐受能力

2.2.5.2 丁酸梭菌的耐酸性能試驗(yàn)（圖8）

圖8 丁酸梭菌Y-1對(duì)酸的耐受能力

由圖8可知，丁酸梭菌在pH值6～7范圍內(nèi)能夠正常生長(zhǎng)，隨著pH值的不斷降低，酵母的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，當(dāng)pH4.0時(shí)，丁酸梭菌已基本不再生長(zhǎng)。因此可以確定，該丁酸梭菌的耐酸能力最低pH值為4.0。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從朗姆酒發(fā)酵底液中篩選得到1株丁酸梭菌（命名為Y-I），菌株Y-1為革蘭氏陽(yáng)性菌，嚴(yán)格厭氧，表面光滑、有光澤，奶油色，自身不水解明膠，可將麥芽糖和淀粉水解。

實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株Y-1的生長(zhǎng)特性進(jìn)行初步探究，發(fā)現(xiàn)菌株在梭菌增殖培養(yǎng)液中最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH7，菌株對(duì)于酒精的最高耐受能力為9%vol，耐酸最低pH值為4.0。

[1]FANG Z,ZHANG Y,Lü Y,et al.Phenolic compounds and antioxidant capacities of bayberry juices[J].Food chemistry,2009,113(4)：884-888.

[2] 趙熙,冉陸,楊寶蘭,等.丁酸梭菌活菌制劑對(duì)腸道菌群影響研究[J].中國(guó)微生物學(xué)雜志,1999,12(6)：332-333.

[3] 冉雪松,王振華,潘康成.丁酸梭狀芽孢桿菌的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(4)：37-39.

[4] 張凌玲,王素娟,龍?jiān)诰?益生菌對(duì)腸易激綜合征患者腸道微環(huán)境及免疫功能影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,20(28)：5552-5555.

[5] 鄧慶,廖美德.多種除氧技術(shù)培養(yǎng)丁酸梭菌的研究[J].中國(guó)釀造,2013,32(10)：44-48.

[6]BENNO Y,SAWADA K,M ITSUOKA T.The intestinal microflora of infants:composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants[J].Microbiology and immunology,1984,28(9)：975-986.

[7] 鄒毅.低濃度糖漿生產(chǎn)重質(zhì)朗姆酒的方法：CN102952665A[P].2013-03-06.

[8] 賈樹彪,李盛賢,吳國(guó)峰.新編酒精工藝學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2004：247-252.

[9]FAHRASMANE L,PARFARTA,JOURET C,et al.Production of higher alcohols and short chain fatty acids by different yeast used in rum fermentation[J].Journal of food sciences,1985,50(5)：1427-1436.

[10]DA PORTO C,DECORTI D,TUBARO F.Evaluation of volatile compounds and antioxidant capacity of some commercial rums from Dominican republic[J].International journal of food science and technology,2011,46(5)：988-993.

[11] 周新虎,陳翔,李浩.有益功能微生物在釀酒生產(chǎn)中的研究及應(yīng)用[J].釀酒,2013(9)：33-38.

[12] 布坎南.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].9版.北京：科學(xué)出版社,1995：776-780.

[13] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2001：358-364.

[14] 匡群,孫梅,施大林.酪酸梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)條件的研究[J].飼料工業(yè),2005,26(10)：36-39.

[15] 趙建新,張灝,田豐偉.丁酸菌的分離、鑒定及篩選[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2002,21(6)：597-601.

[16] 揚(yáng)桂蘋.丁酸菌的生物功能研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1998,10(5)：306-531.

[17]LACHENMEIER D W,ATTIG R,FRANK W,et al.The use of ion chromatography to detect adulteration of vodka and rum[J].European food research and technology,2003,218(1)：105-110.

[18] 李祺德,康云川,張代芬.甘蔗糖蜜酒精工藝學(xué)[M].昆明：云南教育出版社,1993：193-195.

[19]LEE W C,YUSOF S,HAMID N S A,et al.Optimizing conditions for enzymatic clarification of banana juice using response surface methodology(RSM)[J].Journal of food engineering,2006,73(1)：55-63.

[20] PINO J A.Characterization of rum using solid-phase micro-extraction with gas chromatography-mass spectrometry[J].Food chemistry,2007,104(1)：421-428.

Isolation and Identification of Clostridium butyricum and Study of Its Basic Characteristics

FAN Xiaolu1,ZHANG Weili1,WU Youru1,ZOU Yi2and LI Nan1
(1.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004;2.Sugar Industry Engineering Research Center,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004,China)

9 pure strains were isolated from dunder liquid(added during rum fermentation process)through anaerobic incubation.One of the strains was named Y-1 and it was identified as Clostridium butyricum after physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis.The basic growth characteristics of Y-1 as well as its security were studied.The results demonstrated its strong tolerance to acid and alcohol,and its great capacity of producing acids.The optimum temperature for its growth was 37℃,the best growth pH was 7.0,and its fullest tolerance to alcohol was 9%vol and to acid was pH 4.0.Besides,it played an important role in the process of rum fermentation as the functional microorganism for the formation of fragrance and taste.

rum;dunder;Clostridium butyricum;isolation;identification

TS262.28；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2017）11-0031-07

10.13746/j.njkj.2017180

2017-06-20

樊曉璐(1994-)，在讀碩士研究生，研究方向：功能微生物對(duì)果酒發(fā)酵的影響。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-08-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170817.1424.009.html。