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        類賴氨酰氧化酶1在翼狀胬肉中的表達*

        2017-11-21 02:40:14覃瑞馬文豪羅燕妮施智敏陸麗麗覃志良
        關(guān)鍵詞:翼狀胬肉賴氨酸

        覃瑞,馬文豪,羅燕妮,施智敏,陸麗麗,覃志良

        (右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科,廣西 百色 533000)

        類賴氨酰氧化酶1在翼狀胬肉中的表達*

        覃瑞,馬文豪,羅燕妮,施智敏,陸麗麗,覃志良

        (右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科,廣西 百色 533000)

        目的 通過檢測正常結(jié)膜組織和翼狀胬肉中類賴氨酸氧化酶1(LOXL-1)的表達,探討LOXL-1在翼狀胬肉發(fā)展過程中的影響及意義。方法 采用免疫組織化學(xué)檢查正常結(jié)膜組織(19例)和翼狀胬肉組織(25例)中LOXL-1的表達情況,測定兩組免疫組織化學(xué)結(jié)果的光密度值。結(jié)果 正常結(jié)膜組織與翼狀胬肉中LOXL-1的光密度值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),正常結(jié)膜組織偏低。結(jié)論 翼狀胬肉組織中LOXL-1的表達較正常結(jié)膜組織高,LOXL-1在翼狀胬肉發(fā)展中起到了促進的作用。

        類賴氨酸氧化酶1;翼狀胬肉;表達

        類賴氨酰氧化酶 1(lysyloxidase like 1,LOXL-1)是 LOX家族中的一員,它們是 LOX、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3和LOXL-4。LOXL-1對于纖維蛋白的形成起重要的作用,LOX的所有家中成員,都含2個高度保守的區(qū)域,第一個連接于N末端,一共是4個組氨酸,它是銅離子結(jié)合的部位,另外一個區(qū)域連接于C末端,其中含有絡(luò)氨酸的殘基,此區(qū)是催化的區(qū)域,和賴氨酸結(jié)合,形成催化基團-賴氨酰絡(luò)氨基醌,LOX通過氧化膠原蛋白和彈性蛋白的賴氨酸殘基來起始這些纖維性蛋白的共價交聯(lián)[1]。LOX能促進細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白和彈性蛋白的結(jié)合,以共價鍵的形式交聯(lián),形成穩(wěn)定的纖維結(jié)締組織,在多個組織和器官中,起著支持和維護的作用。但在一些疾病中,纖維結(jié)締組織的過度增生,導(dǎo)致了疾病的進一步發(fā)展,LOXL-1過度表達,引起細(xì)胞外纖維蛋白的過度交聯(lián),引起漸進的、不可逆的組織纖維化,在眼表的疾病中,表現(xiàn)為膠原蛋白沉積,與彈性蛋白交聯(lián),啟動纖維蛋白不定向的、復(fù)雜的交織,引導(dǎo)翼狀胬肉的進一步發(fā)展[2]。本文通過免疫組織化學(xué),測定翼狀胬肉中LOXL-1的陽性率,分析LOXL-1的含量與翼狀胬肉的關(guān)系,或有助于闡明翼狀胬肉發(fā)病機制。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        1.1.1 實驗標(biāo)本和分組 告知患者選取標(biāo)本不影響傷口愈合并取得其同意后取外傷患者撕裂的鼻側(cè)結(jié)膜組織,或眼球摘除、義眼臺植入患者的鼻側(cè)結(jié)膜組織,水平、垂直約1 mm×3 mm,以上患者排除翼狀胬肉、瞼裂斑或其他可能導(dǎo)致纖維增生的眼表疾病,共15例,作為陰性對照組。取翼狀胬肉患者鼻側(cè)切除的翼狀胬肉頭部組織大約1 mm×3 mm,共25例作為實驗組。取原發(fā)性肝細(xì)胞癌3例行免疫組織化學(xué)檢查作為陽性對照組[3]。標(biāo)本置液氮中保存。

        1.1.2 主要試劑和儀器 Max Vision試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),Rabbit anti-LOXL1(北京奧森生物技術(shù)有限公司)。德國美康石蠟切片機、石蠟包埋機。

        1.2 方法

        參照文獻[4]進行免疫組織化學(xué)實驗。其中LOXL-1抗體的濃度為1︰100。

        1.3 記錄結(jié)果

        取40×10高倍鏡下截圖進行分析,每張切片隨機選取5個視野進行截圖,采用ImagePro Plus 6.0軟件進行分析計算,記錄其累計光密度值(integrated optical density,IOD),每個切片截圖后取算術(shù)平均值作為該切片IOD值[5]。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用兩組間雙側(cè)t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        3組的LOXL-1免疫組織化學(xué)結(jié)果表明LOXL-1被染成紫藍色,在實驗組、陰性對照組及陽性對照組中均有不同程度著色,但因LOXL-1含量不同,其累積著色面積不同。實驗組著色深藍色,著色面積、著色點數(shù)較陽性對照組大、多。陰性對照組著色淺藍,著色面積小,著色點數(shù)少。陽性對照組中,原發(fā)性肝細(xì)胞癌LOXL-1著色明顯深,著色點數(shù)多,面積大。另外,在陽性對照組及實驗組中,纖維化明顯、清晰可見。而陰性對照組中,纖維化極少或者極輕。見圖1~3。采用ImagePro Plus對實驗組和對照組進行光密度測量,實驗組IOD值為(235 983.920±80 313.409),陰性對照組 IOD值為(38 112.580±23 381.950),經(jīng)兩獨立樣本t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見附表和圖4。

        圖1 LOXL-1在陽性對照組中的表達

        圖2 LOXL-1在陰性對照組中的表達

        圖3 LOXL-1在實驗組中的表達

        附表 LOXL-1在陰性對照組和實驗組的IOD值 (±s)

        附表 LOXL-1在陰性對照組和實驗組的IOD值 (±s)

        組別P值對照組(n=19) 0.000實驗組(n=25)IOD值 t值38 112.580±23 381.950 -10.384 235 983.920±80 313.409

        圖4 陰性對照組和實驗組IOD值比較

        3 討論

        翼狀胬肉是我國常見病,多發(fā)病,其發(fā)病機制不詳。經(jīng)常規(guī)的HE染色發(fā)現(xiàn),主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞、新生的毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞為主。其觸發(fā)可能為眼表結(jié)構(gòu)的破壞,然后是角膜緣干細(xì)胞的破壞、角膜緣屏障的破壞,炎癥的侵入,促進了翼狀胬肉的發(fā)展,其發(fā)展過程中,與彈性和膠原蛋白的交聯(lián)關(guān)系密切,LOXL-1在纖維交聯(lián)的過程中,起到了重要的促進作用。因此,研究LOXL-1在翼狀胬肉中的表達和調(diào)控,可能對翼狀胬肉的發(fā)展起到干擾或者阻止的作用。

        本研究表明,翼狀胬肉中LOXL-1在翼狀胬肉中的表達,高于非翼狀胬肉外傷患者的結(jié)膜組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。推測LOXL-1在翼狀胬肉發(fā)展的過程中,起到了促進的作用。LOXL-1在多種疾病中均有表達,在纖維化過度的疾病中表達增高,在纖維化減少的疾病中表達減少[6],因此,可以推測,LOXL-1在纖維化過度的疾病中,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其他纖維化過度疾病的治療藥物,也可能用于翼狀胬肉的治療。目前纖維化過度疾病的治療,尚無有效的可逆轉(zhuǎn)的藥物,翼狀胬肉的藥物治療應(yīng)當(dāng)側(cè)重于早期翼狀胬肉的治療及預(yù)防,干預(yù)、調(diào)控LOXL-1的表達,阻止纖維化的進展,干擾翼狀胬肉的進一步形成,達到治療的目的。

        LOXL-1的基因定位,在于第15對染色體q24~25,另外在q22部分區(qū)段也有編碼。作為一種分泌蛋白,LOXL-1首先合成其前體,于高爾基體內(nèi),被糖基修飾,當(dāng)它分泌出細(xì)胞的時候,以酶原的形式泌出,在C蛋白或Tolloid蛋白水解酶的作用下,賴氨酰氧化酶水解為2部分,一部分是游離催化劑,另一部分是氨基末端的前肽區(qū)域,成為具有活性的LOXL-1,促使彈性蛋白和膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)的交聯(lián)。LOXL-1表達過度的時候,引起細(xì)胞外纖維蛋白的過度交聯(lián),引起漸進的、不可逆的組織纖維化,在眼表的疾病中,表現(xiàn)為膠原蛋白沉積,與彈性蛋白交聯(lián),啟動纖維蛋白的形成,誘發(fā)翼狀胬肉[7]。在翼狀胬肉的發(fā)病機制中,纖維蛋白的形成是翼狀胬肉中重要組成部分,因此,闡明翼狀胬肉中影響纖維蛋白的形成的因素,可能對闡明翼狀胬肉的發(fā)病機制,起到關(guān)鍵的作用。關(guān)于LOXL-1催化的交聯(lián)機制,目前知道,在LOXL-1的催化作用下,分泌的膠原蛋白組織組織中含有賴氨酸的肽鏈,包括賴氨酸殘基和羥賴氨酸殘基,以及彈性蛋白中的賴氨酸殘基,在氧化作用下,釋放一個帶正電荷的氨離子,形成了氨基醛的基團,失去一個正電子的氨基醛的基團又可以與鄰近未修飾的賴氨酸NH2端,脫氫形成賴氨酸正亮氨酸,完成了2個肽基的的交聯(lián)。另外,上述2個氨基醛之間,也可通過醛基的相互反應(yīng),形成醛醇縮合物,再完成另外的交聯(lián),醛醇縮合物還能在縮合、多個反應(yīng)的作用下,在不同的肽基氨之間,形成穩(wěn)固的網(wǎng)線狀結(jié)構(gòu),在細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維結(jié)締組織網(wǎng),穩(wěn)固了組織和器官。翼狀胬肉中,以上的膠原蛋白和彈性交聯(lián)不斷形成,促進了翼狀胬肉的發(fā)展,阻斷以上的交聯(lián)過程,可能起到阻止翼狀胬肉發(fā)展的作用。

        銅離子是LOXL-1重要的輔助基團,銅離子與其結(jié)合后,激活LOXL-1的活性,可將伯胺氧化成醛,所以,進一步測定翼狀胬肉銅離子的含量,對于LOXL-1的表達,起到佐證的作用,翼狀胬肉中銅離子的增減、置換或者還原翼狀胬肉中的銅離子,必然對LOXL-1的活性產(chǎn)生影響,影響翼狀胬肉中彈性蛋白和膠原蛋白的交聯(lián),干擾翼狀胬肉的進一步發(fā)展。

        在翼狀胬肉發(fā)病機制中,目前尚存在幾個方面的未知。①翼狀胬肉的觸發(fā),在何種條件下,翼狀胬肉會發(fā)病,目前認(rèn)為可能與炎癥、紫外線照射等關(guān)系密切。②人類機體存在的對翼狀胬肉的防衛(wèi)、阻止機制,什么時候開始失去,推測可能與角膜緣干細(xì)胞屏障的破壞有關(guān)。③翼狀胬肉發(fā)展的方向,為什么是指向瞳孔,而且一般不超過全部瞳孔,可能與角膜上皮的亞結(jié)構(gòu)損害、瞳孔區(qū)角膜上皮遠離角膜緣干細(xì)胞、角膜上皮修復(fù)相對慢有關(guān)。④翼狀胬肉在發(fā)展的過程中,什么因素起到了推動作用,目前的研究推測,LOXL-1可能在翼狀胬肉發(fā)展的過程中,起到了重要的推動作用。因此,阻止LOXL-1的表達,以及對以上翼狀胬肉4個過程的防治,可能對翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展,起到重要的影響。

        [1]胡玲玲,湯其群,黃海艷,等.賴氨酰氧化酶的結(jié)構(gòu)和功能[J].生命的化學(xué),2009,29(2):291-294.

        [2]覃瑞.翼狀胬肉發(fā)病機制的研究進展[J].右江醫(yī)學(xué),2015,(6):758-760.

        [3]蘭秋紅,楊宗燦,張立達,等.類賴氨酰氧化酶1在肝細(xì)胞癌中的異常表達[J].中華消化雜志,2012,32(8):557-559.

        [4]GEMA E,AARON A,JENS H,et al.Non-image forming light detection by melanopsin,rhodopsin,and long-middlewave(L/W)cone opsin in the subterranean blind mole rat,spalax ehrenbergi:immunohistochemical characterization,distribution,and connectivity[J].Front Neuroanat,2016(10):61.

        [5]李劍,孫啟玉,張學(xué)軍,等.腹股溝直疝及斜疝患者腹橫筋膜原纖維蛋白-1、轉(zhuǎn)化生長因子β1、類賴氨酰氧化酶1的表達研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(6):47-50.

        [6]KOW N,RIDGEWAY B,KUANG M,et al.Vaginal expression of LOXL1 in premenopausal and postmenopausal women with pelvic organ prolapse[J].Female Pelvic Med Reconstr Surg,2016,22(4):229-235.

        [7]CORAL K,ANGAYARKANNI A,MADHAVAN J,et a1.Lysyl oxidase(LOXL)activity in the ocular tissues and the role of LOXL in proliferative diabetic retinopathy and rhegrnatogenous retinal detachment[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(11):4746-4752.

        (張蕾 編輯)

        Expression of lysyloxidase like 1 in pterygium*

        Rui Qin,Wen-hao Ma,Yan-ni Luo,Zhi-min Shi,Li-li Lu,Zhi-liang Qin
        (Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Youjiang Medical Univercity for Nationalities,Baise,Guangxi 533000,China)

        Objective To compare the expression of lysyloxidase like 1(LOXL-1)in normal conjunctiva tissues and pterygium,and explore the influence and significance of LOXL-1 in the course of pterygium development.Methods Using immunohistochemistry,LOXL-1 expression in normal conjunctiva tissues(19 cases)and pterygium(25 cases)was examined,optical density value was detected.Thenttest was carried out.Results The optical density value in the normal conjunctiva tissues was lower than that in the pterygium(P<0.05).Conclusions The expression of LOXL-1 in pterygium is higher than that in normal conjunctiva tissues.LOXL-1 plays an important role in promoting the development of pterygium.

        LOXL-1;pterygium;expression

        R772

        A

        10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.006

        1005-8982(2017)25-0028-04

        2016-12-09

        百色市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項目(No:百科技20160619);廣西壯族自治區(qū)中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目[No:桂教科研(2017)16號]

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