王桂東 ，王曉燕 ，馬璨粲 ，高秀展 ，孫學春

（1.山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，山東 臨沂 276001；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院 檢驗科，山東 臨沂 276000）

某院348株銅綠假單胞菌耐藥性分析及多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測

王桂東1，王曉燕1，馬璨粲1，高秀展1，孫學春2

（1.山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，山東 臨沂 276001；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院 檢驗科，山東 臨沂 276000）

目的 研究該院檢出的348株銅綠假單胞菌（PAE）耐藥性及多重耐藥PAE耐藥基因檢測。方法將血液科檢出348例PAE菌株進行體外耐藥監(jiān)測，并對其中36株多重耐藥PAE菌株進行耐藥相關(guān)基因OprD2、VIM、GIM、SPM、IMP-1、TEM、VEB、PER、aac（3）-Ⅲ、aac（6）’-Ib-Cr、qnrA、qnrS、qnrD檢測。結(jié)果多重耐藥PAE對妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、美羅培南比較敏感，對其他臨床常用抗生素均有明顯的耐藥性，PCR基因分析結(jié)果顯示，OprD2和IMP-1基因陽性率分別為97.22%和94.44%，aac（3）-Ⅲ和aac（6）'-Ib-Cr陽性率分別為 38.89%和 27.78%，TEM 陽性率為 75.00%，qnrA、qnrS和qnrD陽性率為 50.00%、61.11%和47.22%，其他基因低于15.00%。結(jié)論 PAE耐藥性較強，多重耐藥PAE耐藥基因主要為OprD2和IMP-1基因。

銅綠假單胞菌；耐藥基因；耐藥機制；血液科

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）作為院內(nèi)感染常見的條件致病菌之一，常導致免疫功能不全的患者和抵抗力明顯低下患者發(fā)生明顯菌血癥，嚴重可致使患者死亡[1-2]。多重耐藥PAE菌株的研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，其基因結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，常攜帶一種或者幾種抗藥基因，因此，PAE患者易發(fā)生耐藥性，給抗感染治療帶來較大困難。血液科部分患者如白血病、多發(fā)性骨髓瘤和霍奇金病等抵抗力較為低下，PAE作為條件致病菌易侵犯抵抗力低下和進行侵襲性操作患者，故血液科易并發(fā)PAE院內(nèi)感染。目前，對PAE感染的耐藥性基因型研究分析仍較少，因此，應(yīng)充分了解PAE在血液科傳播的流行特征和耐藥性基因結(jié)構(gòu)特點，以便采取更為有效的防治措施。本研究對血液科檢出的PAE菌株進行體外藥敏實驗檢測，并對其中的15例多重耐藥菌株進行耐藥基因的分型檢測，以便從分子水平認識PAE多重耐藥性的相關(guān)分子機制。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

PAE菌株全部分離自2013年1月-2015年12月臨沂市腫瘤醫(yī)院血液科患者的痰、中段尿、血液、骨髓、腹水等標本，所有菌株采用法國生物梅里埃VITEK2-compact鑒定。質(zhì)控菌株購自衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心的PAE ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603等。

1.2 藥物敏感實驗

采用K-B法進行藥物敏感實驗，MH平板購自法國生物梅里埃公司，藥物敏感紙片和抗生素均購自英國Oxoid公司。主要檢測抗生素有慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、妥布霉素、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南。

1.3 儀器與試劑

實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）擴增儀采用 ROCHE LC480，凝膠成像系統(tǒng)采用BIO，電泳為Biorad mini-4電泳儀，瓊脂糖和部分其他試劑均購自美國Sigma公司。PCR引物和DNA marker由上海生物生工有限公司合成提供（見表1）。PCR試劑盒由凱杰生物工程（深圳）有限公司提供。

表1 耐藥基因PCR引物序列及目的產(chǎn)物長度

1.4 細菌基因組DNA模板的制備及細菌DNA的提取

用接種環(huán)挑取純菌落接種于5 ml LB肉湯培養(yǎng)液，將裝有LB培養(yǎng)液的試管置于震蕩培養(yǎng)箱中，37℃，200 r/min，18～20h培養(yǎng)至細菌生長對數(shù)期，然后取3 ml培養(yǎng)液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行操作，提取的DNA模板于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 耐藥基因的檢測

各種靶基因PCR擴增體系均為：總反應(yīng)體積20μl，其中 P1、P2 引物各 1μl，Premix Taq DNA 聚合酶 10μl，滅菌蒸餾水 7μl，模板液 1μl。熱循環(huán)參數(shù)為：90℃預變性 4 min，93℃變性 50 s、55℃退火50 s、72℃延伸 60 s，40 個循環(huán)后 72℃延伸 6 min；用雙蒸滅菌水作模板設(shè)陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后取5μl PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染液染色，同時加核酸電泳相對分子質(zhì)量標準鑒定擴增DNA片段的大小。用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

對348例患者進行回顧性調(diào)查分析，計數(shù)資料用率（%）來表示。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感實驗結(jié)果

PAE對抗生素的藥物敏感實驗結(jié)果顯示，多重耐PAE對氨基糖苷類的阿米卡星與喹諾酮類的左氧氟沙星耐藥率相對較低，分別為19.83%和20.98%，β-內(nèi)酰胺酶類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺酶與酶抑制劑復合物等抗菌藥物的耐藥率均>70%，提示實驗菌株包含不同種類的耐藥基因。見表2。

2.2 耐藥基因分析結(jié)果

36例多重耐藥菌株real-time PCR定量分析顯示，OprD2和IMP-1基因陽性率分別為97.22%和94.44%，aac（3）-Ⅲ和aac（6）’-Ib-Cr陽性率分別為38.89%和 27.78%，TEM陽性率為 75.00%，qnrA、qnrS和qnrD陽性率為50.00%、61.11%和47.22%，其他基因低于15.00%。見表3。

表2 348株P(guān)AE對17種抗生素的耐藥性

表3 36例多耐藥的PAE耐藥基因檢測陽性率

3 討論

隨著人類對抗生素新藥物的不斷研發(fā)以及抗生素濫用，條件致病菌PAE在院內(nèi)感染的檢出率越來越多。血液科患者常抵抗力低下、部分患者進行大劑量放化療或者激素應(yīng)用使得機體免疫力降低，并且常有部分侵襲性操作如骨髓穿刺等，綜合這些因素易導致血液科發(fā)生PAE感染，病情復雜而難控制[5-6]。通過對本院血液科患者標本的分析顯示，PAE對各種抗生素（除亞胺培南和美羅培南）的耐藥率為30%左右，其他藥物耐藥率均達到60%以上，部分抗生素耐藥率達到95%以上。為此，亟需對血液科PAE的耐藥基因型進行分析，以便更好地進行檢測和應(yīng)用抗生素進行早期的控制。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[9]，PAE通過產(chǎn)酶、膜孔蛋白缺失、泵出機制、生物膜形成、青霉素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)改造等機制使其自身獲得耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，OprD2基因型的陽性率為97.22%，且PAE對亞胺培南的耐藥率達到90%以上，可見，在該院血液科PAE對亞胺培南的耐藥的機制與OprD2的缺失存在相關(guān)性，主要是因為OprD2作為膜上的一種孔道蛋白具有配體特異性，可以特異性結(jié)合亞胺培南，從而有助于發(fā)揮抗菌藥性[7-8]。由于這種特異性結(jié)合的存在，β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物很難通過，故其與碳青霉烯類抗菌藥物常無明顯的交叉耐藥性。此外，本研究檢測4種金屬酶基因發(fā)現(xiàn)僅有IMP-1的陽性率為94.4%，其余VIM、GIM、SPM的陽性率較低，可見PAE對碳青霉烯類耐藥的機制可能與金屬酶存在相關(guān)性。既往研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，PAE對碳青霉烯類等多種抗生素產(chǎn)生多重耐藥的重要機制就是PAE分泌金屬酶。金屬酶為異基因家族構(gòu)成，其酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)的相似性較低，而三級和四級的空間結(jié)構(gòu)存在高度的一致性，且金屬酶依賴于鋅離子可以降解碳青霉烯類抗生素，對單環(huán)列抗生素和螯合劑敏感等特點。

PAE對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率均在90%以上，進一步分析發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類修飾酶基因aac（3）-Ⅲ、aac（6）’-Ib-Cr的陽性率均達到 90%以上，二者均可以通過對氨基糖苷類抗菌藥物的修飾產(chǎn)生抗藥性，并且aac（6）’-Ib-Cr對喹諾酮類抗菌藥物也存在修飾作用，從而產(chǎn)生多重耐藥性[13-15]。

本研究中對質(zhì)粒介導的qnr基因誘導產(chǎn)生氟喹諾酮類耐藥的陽性檢出率達到50%以上，主要以qnrS型基因為主，為此本研究中同樣檢測到PAE對氨基糖苷類藥物的耐藥性。此外PAE具有廣譜的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性，耐藥率均達到90%，且檢測TEM、VEB、PER等基因型，但具體的機制有待進一步研究。

綜上所述，PAE耐藥性較強，多重耐藥PAE耐藥機制復雜，耐藥基因最常見為OprD2和IMP-1基因。

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（張蕾 編輯）

Analysis of drug resistance of 348 strains ofPseudomonas aeruginosain our hospital and detection of drug resistance genes ofPseudomonas aeruginosa

Gui-dong Wang1,Xiao-yan Wang1,Can-can Ma1,Xiu-zhan Gao1,Xue-chun Sun2
(1.Clinical Laboratory,Linyi Tumour Hospital,Linyi,Shandong 276001,China;2.Clinical Laboratory,Linyi People's Hospital,Linyi,Shandong 276000,China)

Objective To investigate the drug resistance of 348 strains ofPseudomonas aeruginosa(PAE)and detection of drug resistance genes of multidrug-resistant PAE in our hospital.MethodsIn vitroresistance monitoring was performed in 348 strains of PAE isolated in the Department of Hematology.In the 36 multi-drug resistant strains of PAE,RT-PCR was used to determine drug resistance genes which includedOprD2,VIM,GIM,SPM,IMP-1,TEM,VEB,PER,aac(3)-III,aac(6)'-Ib-Cr,qnrA,qnrS and qnrD.Results Multidrug-resistant PAE strains were highly sensitive to Tobramycin,Piperacillin/Tazobactam,and Meropenem,but were obviously resistant to other commonly-used antibiotics.PCR analysis showed that the positive rates ofOprD2,IMP-1,TEM,qnrS,qnrA,qnrD,aac(3)-III and aac(6)'-Ib-Crgenes were 97.22%,94.44%,75.00%,61.11%,50.00%,47.22%,38.89%and 27.78%respectively,while the positive rates of others genes were less than 15.00%.Conclusions Drug resistance ofPseudomonas aeruginosais strong,and the resistance genes of multidrug-resistantPseudomonas aeruginosaare mainlyOprD2andIMP-1genes.

Pseudomonas aeruginosa;resistance gene;resistance mechanism;Department of Hematology

R446

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.025

1005-8982（2017）25-0119-04

2016-10-28