李茂，馮建國，王曉斌，陳前修，萬運強

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 麻醉科，四川 瀘州 646000）

基礎研究·論著

MicroRNA-29b-3p重組腺相關病毒制備及在大鼠前額葉皮質(zhì)中的表達研究*

李茂，馮建國，王曉斌，陳前修，萬運強

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 麻醉科，四川 瀘州 646000）

目的 獲得表達microRNA-29b-3p的重組腺相關病毒（rAAV-miR-29b-3p），并檢測其在大鼠前額葉皮質(zhì)中的感染效果和表達水平。方法 將前體miR-29b-3p基因片段置入AAV表達質(zhì)粒中構建重組AAV質(zhì)粒，將重組AAV質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒通過脂質(zhì)體LipaFiterTM共轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝rAAV-miR-29b-3p。從轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中收集并通過樹脂柱純化rAAV-miR-29b-3p，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）測定rAAV-miR-29b-3p滴度。通過腦立體定位儀注射rAAV-miR-29b-3p至大鼠前額葉皮質(zhì)，免疫熒光顯微鏡觀察rAAV-miR-29b-3p的感染效果，qRT-PCR檢測rAAV-miR-29b-3p表達水平。結果 成功包裝的rAAV-miR-29b-3p經(jīng)純化后獲得了高純度的rAAV-miR-29b-3p，qRT-PCR檢測rAAV-miR-29b-3p的病毒滴度達到1.0×1012vg/ml，經(jīng)感染21 d后，腦組織前額葉皮質(zhì)熒光表達明顯，miR-29b-3p表達水平明顯提高。結論 構建的rAAV-miR-29b-3p可使大鼠前腦皮層miR-29b-3p高表達，為進一步研究miR-29b-3p的生物學功能提供了有效工具。

腺相關病毒；miRNA-29b-3p；前額葉皮質(zhì)；大鼠

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA分子，能編碼調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。近年來研究表明miRNAs與膀胱癌、乳腺癌、結腸腺癌等腫瘤[1]，抑郁癥、精神分裂癥、焦慮癥等精神疾病[2]的發(fā)生發(fā)展相關。前期研究結果發(fā)現(xiàn)氯胺酮抗抑郁作用可能通過 microRNA-29b-3p（miR-29b-3p）發(fā)揮作用（結果還未發(fā)表），然而具體機制不清楚。為了進一步研究miR-29b-3p的功能，克隆miR-29b-3p的基因片段以及高表達miR-29b-3p是重要的研究手段。重組腺相關病毒（recombination adeno-associated virus，rAAV）作為一種載體工具發(fā)揮著重要的作用。

本研究的目的是構建含有miR-29b-3p的重組腺相關病毒，并包裝純化病毒，然后通過腦立體定位儀注射rAAV-miR-29b-3p感染大鼠前額葉皮質(zhì)，觀察大鼠前額葉皮質(zhì)感染效果及表達miR-29b-3p情況，為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒、總RNA提取試劑盒購自中國天根生化科技公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Premega公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自德國Qiagen公司，XbaⅠ和AgeⅠ內(nèi)切酶購自英國NEB公司，T4連接酶購自日本TaKaRa公司，pfu高保真酶購自中國天根生化科技公司，引物序列表內(nèi)引物均購自生工生物工程上海有限公司，TOP10感受態(tài)細胞購自中國康 為 世 紀 公 司 ，pAAV-u6-IRES-hrGFP，pAAV-RC和pHelper質(zhì)粒購自英國Cell Biolabs公司，人胚腎細胞系HEK293 cell、LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑購自中國漢恒生物科技公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購于美國Hyclone公司，濾膜濾器購自美國Millipore公司，SD大鼠由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 前體miR（pre-miR）的擴增

經(jīng)查找miRBase基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.mir base.org），發(fā)現(xiàn)在大鼠基因組上有3個基因位點可以編碼miR-29b-3p的“莖環(huán)”結構，分別為rnomiR-29b-1（MI0000864，4 號染色體58100133 bp-58100053 bp）、rno-miR-29b-2（MI0000862，1 號染色體39612388 bp-39612468 bp）和rno-miR-29b-3（MI0031777，13號染色體118329450bp-118329530bp），本研究以rno-miR-29b-1的“莖環(huán)”結構為基礎，正向延長81 bp以及反向延長100 bp，即基因組定位片段為1號染色體58100214~58099953 bp，作為 pre-miR-29b-3p的基因片段。然后，選用雄性SD大鼠，正常飼養(yǎng)1周后，用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后斷頸處死，取出腦組織兩側(cè)前額葉皮質(zhì)于滅酶EP管，放入液氮罐中，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。本研究得到西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會同意。將取得的前額葉皮質(zhì)組織用DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，以基因組為模板，用pre-miR-29b-3p的特異性引物rat-29-AgeⅠ-F和rat-29-XbaⅠ-R（見表 1），PCR 擴增出 miR-29b-3p的基因片段，PCR反應程序：95℃5 min，95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，32 個循環(huán)，72℃ 10 min。

1.3 重組質(zhì)粒構建

用XbaⅠ和AgeⅠ內(nèi)切酶同時酶切1.2中得到的pre-miR-29b-3p基因片段和pAAV-U6-IRES-hrGFP質(zhì)粒，37℃酶切過夜，雙酶切產(chǎn)物命名為：miR-29b-3p-DD，pAAV-U6-IRES-hrGFP-DD，T4連接酶 16℃連接60 min，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細胞中，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，次日挑取單個菌落，挑取的菌落進行菌落PCR，產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶，同時將挑取的菌落加入含有氨芐青霉素抗性的25 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖菌過夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶，將菌落PCR和雙酶切鑒定正確的菌落，送華大基因（中國重慶）測序，經(jīng)序列比對，結果正確的重組質(zhì)粒命名為pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP。

1.4 rAAV包裝、純化及滴度鑒定

HEK293細胞用DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清在5%的二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，胰酶消化HEK293細胞，將細胞接種于培養(yǎng)皿中，80%～90%滿即可進行轉(zhuǎn)染。用LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑，將pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP重組表達質(zhì)粒、pAAV-RC和 pHelper共轉(zhuǎn)染到 HEK293細胞中，轉(zhuǎn)染72 h后即可包裝得到重組腺相關病毒rAAV-miR-29b-3p。收集所有細胞于15 ml離心管中并加入300μl的PBS，液氮及37℃水浴反復凍融3次，3 000 r/min離心5 min，收集病毒上清液，將病毒上清液于0.45μm濾膜過濾，樹脂柱純化后，最終得到純化后的病毒約200μl，于-70℃保存，使用qITR-F和qITR-R引物（見表1）進行qRT-PCR滴度鑒定，標準品的拷貝梯度為 105、106、107、108、109和 1010，qRT-PCR 反 應 程序 ：95℃ ，10 min；40 個PCR 循環(huán)[95℃，10 s，60℃，60 s（收集熒光）]，根據(jù) Ct值（average）和對應的拷貝數(shù)，做1元1次函數(shù)曲線，并換算成拷貝數(shù)10X及病毒滴度vg/ml。rAAV病毒滴度 =10X×40 000 vg/ml。

表1 引物序列表

1.5 rAAV-miR-29b-3p感染大鼠前額葉皮質(zhì)

雄性SD大鼠15只，180～220 g，正常飼養(yǎng)1周后隨機分為正常組5只：腦立體定位注射0.9%生理鹽水（NS）；腺相關病毒實驗組5只：腦立體注射rAAV-miRNA-29b-3p腺相關病毒；腺相關病毒對照組5只：腦立體注射攜帶rAAV-GFP腺相關病毒。主要操作步驟為：1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，以前囟為原點，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜（Paxinos and Watson，2007）選定坐標，顱鉆鉆孔至腦膜見腦脊液流出，前額皮質(zhì)坐標為：A/P+4.7 mm，M/L±2 mm，D/V-1mm，用2μl微量注射器吸取腺相關病毒2μl，以0.2μl/min的速度注射5 min，每側(cè)注射1μl，每次留針10 min，緩慢出針，先行一側(cè)注射，再按相同步驟行對側(cè)注射，碘伏消毒切口，縫合皮膚，放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。21 d后，用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后斷頸處死，取出腦組織，一側(cè)大鼠腦前額葉皮質(zhì)迅速冷凍切片，通過固定、核染色以及封片等處理后在熒光顯微鏡下觀察熒光強度；另一側(cè)大鼠腦前額葉皮質(zhì)于滅酶EP管，放入液氮罐中，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.6 qRT-PCR

使用總RNA提取試劑盒一步法提取各組前額葉皮質(zhì)大腦組織的總RNA，用miR-29b-3p的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物Rno-miR-29b-3p-RT（見表1）逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，U6作為內(nèi)參基因，其特異性逆轉(zhuǎn)錄引物為Rno-U6-RT（見表1）。將所有cDNA樣品分別配置Real-time PCR 10μl反應體系，qRT-PCR反應程序：95℃，10 min；40 個 PCR 循環(huán)[95℃，10 s，60℃，60 s（收集熒光）]，擴增反應結束后，按 95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s，建立 PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，并從60℃緩慢加熱到99℃，以樣品miRNA-29b-3p的特異引物rno-miR-29b-3p-qF和內(nèi)參（r no-U6）的特異引物 rno-miR-U6-qR及相同的rno-miR-qR引物（見表1），分別進行Real-time PCR反應，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。

1.7 免疫熒光

將冷凍切片4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，每次5 min，0.2%Tritox-100溶液作用15 min，PBS洗2次，每次5 min，加1%BSA封閉液室溫作用30 min，PBS洗2次，每次 5 min，DAPI濃度1︰1 000室溫作用5 min，PBS洗3次，每次5 min，封片，免疫熒光顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 pre-miR-29b-3p擴增

根據(jù)對miR-29b-3p“莖環(huán)”結構序列的分析顯示3個不同的“莖環(huán)”結構rno-miR-29b-1、rno-miR-29b-2、rno-miR-29b-3與成熟miR-29b-3p 比對具有相同的成熟miR-29b-3p序列（見圖1A）；構建的pre-miR-29b-3p基因片段約280 bp，紅色序列為“莖環(huán)”結構，紅色序列中下劃線的序列為成熟的miR-29b-3p的編碼序列，整個基因序列兩端下劃線部分為引物序列（見圖1B）。提取的大鼠前額葉皮質(zhì)基因組經(jīng)PCR擴展及純化后經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，在250 bp處上方可見明顯條帶（見圖2A），與預期的約300 bp基因片段大小相符。

圖1 pre-miR-29b-3p擴增結果

2.2 pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP質(zhì)粒構建結果

PCR目的基因產(chǎn)物與pAAV-U6-IRES-hrGFP載體質(zhì)粒雙酶切、連接后得到的重組質(zhì)粒pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP（見圖 2D），轉(zhuǎn)化后得到的5個菌落，經(jīng)PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳后可見菌落編號為U6-5的菌落250 bp處上方有明顯條帶（見圖2B）。菌落U6-5提取出的質(zhì)粒經(jīng)XbaI和AgeI雙酶切、瓊脂糖電泳后，在5 500 bp左右和250 bp上方有明顯條帶（見圖2C）。對菌落U6-5質(zhì)粒上重組片段進行基因測序和比對，比對結果與目的pre-miR-29b-3p基因序列完全一致（見圖 2E）。

圖2 pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP質(zhì)粒構建結果

2.3 rAAV-miR-29b-3p包裝、純化及滴度鑒定結果

根據(jù)qRT-PCR法測得得樣品Ct值（見圖3A），以每組AAV標準品的Ct值其對應拷貝數(shù)的對數(shù)做回歸曲線，計算標準曲線的函數(shù)公式及R2值，通過函數(shù)公式計算待測AAV樣品對應的拷貝數(shù)對數(shù)，換算成拷貝數(shù)10X及病毒滴度vg/ml，得到圖3B標準曲線，計算rAAV-miR-29b-3p病毒滴度如下：rAAV-miR-29b-3p 滴度 =107.41×40 000=1.0×1012vg/ml。

圖3 rAAV-miR-29b-3p滴度鑒定

2.4 大鼠前額葉皮質(zhì)rAAV-miR-29b-3p感染情況

大鼠前額葉皮質(zhì)冷凍切片，通過固定、核染色以及封片等處理后在熒光顯微鏡下觀察到rAAV-GFP和rAAV-miR-29b-3p組綠色熒光表達明顯，而正常組未見綠色熒光表達。見圖4。

圖4 大鼠前額葉皮質(zhì)rAAV-miR-29b-3p感染情況 （×400）

2.5 rAAV-miR-29b-3p感染的前額皮質(zhì)miR-29b-3p表達

qRT-PCR檢測rAAV-miR-29b-3p感染的前額皮質(zhì)miR-29b-3p相對表達量，結果發(fā)現(xiàn)腺相關病毒實驗組大鼠前額皮質(zhì)miR-29b-3p表達水平較腺相關病毒對照組上調(diào)約4倍（見圖5）。

圖5 大鼠前額皮質(zhì)miR-29b-3p相對表達量

3 討論

抑郁癥是一種慢性精神疾病，到2030年，將成為全球第一致殘的疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量，增加經(jīng)濟負擔[3]。雖然目前已進行了很多研究，但具體與抑郁癥相關的細胞和分子機制仍不清楚。目前在抑郁癥與miRNA的研究已經(jīng)證實miR與突觸可塑性障礙、神經(jīng)發(fā)生、單核苷酸多態(tài)性、應激以及多種抗抑郁藥相關[4-7]。

與其他病毒相比，rAAV具有低免疫原性[8]，與逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒不一樣，rAAV不整合入宿主基因組[9]，還能快速使特定區(qū)域相關基因缺失[10]，因此rAAV比逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒能更好研究基因缺失或者表達。rAAV具有不同的血清型，目前人的血清型有12種[11]，不同人源血清型對臟器組織的親和力不同，對腦組織高的血清型是2、4、7～9、rh10，VINCENT[12]已經(jīng)證實 AAV2/9 比 AAV2/2、AAV2/5更有效用于基因刪除或者基因過表達，所以本研究中選擇的血清型為AAV2/9型。隨著AAV載體的不斷發(fā)展完善，其在基因治療中的應用也越來越廣泛，目前rAAV相關的臨床試驗已經(jīng)得到國際的廣泛關注，AAV1、AAV2攜帶α1抗胰蛋白酶通過肌內(nèi)注射治療α1抗胰蛋白酶缺陷癥處于臨床Ⅰ、Ⅱ期；AAV2、AAVrh10攜帶CLN直接顱內(nèi)給藥治療神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病處于臨床Ⅰ期；AAV2攜帶囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白CFTR支氣管噴霧給藥治療囊性纖維化病臨床Ⅰ、Ⅱ期（共完成150個病例）；AAV2攜帶AADC、GAD、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白顱內(nèi)給藥治療帕金森?。ㄅR床Ⅰ、Ⅱ期）等疾病[13-14]，并取得了較好的療效。

本實驗先根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫得到pre-miR-29b-3p基因片段大小約280 bp。大鼠基因組中編碼miR-29b-3p“莖環(huán)”結構的基因位點有3個，理論上3個基因位點的“莖環(huán)”結構經(jīng)過加工均可以形成成熟的miR-29b-3p。本研究選定了miR-29b-1的“莖環(huán)”結構作為擴增pre-miR-29b-3p的模板。提取大鼠的全基因組，PCR特異性擴增出miR-29b-3p基因，由于基因片段上帶有酶切位點，因此miR-29b-3p的基因大小約300 bp與目的條帶相吻合。雙酶切目的基因和載體質(zhì)粒，連接轉(zhuǎn)化后菌落PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可以看到圖2B中U6-5菌落條帶在250bp上方，與miR-29b-3p目的基因大小吻合，為了再次確認U6-5菌落是不是真陽性菌落，雙酶切該菌落的質(zhì)粒，可以看到1條在250 bp上方，1條約5 500 bp，250 bp上方的條帶是miR-29b-3p基因，5 500 bp條帶是質(zhì)粒骨架，為了明確U6-5菌落質(zhì)粒上的基因序列，測序比對結果與基因庫的miR-29b-3p基因序列完全一致，說明pre-miR-29b-3p構建和重組的質(zhì)粒是成功的。

重組的質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒，3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，純化以后的病毒滴度達到了1.0×1012vg/ml，高于感染大鼠腦組織的最低濃度是1.0×109vg/ml，在理想的濃度1.0×1011～1.0×1013vg/ml之間[15]，適用于大鼠腦組織的感染。重組的腺相關病毒注射大鼠前額葉皮質(zhì)21 d后可以看到明顯的綠色熒光表達，說明載體質(zhì)粒上的報告基因hrGFP已經(jīng)表達綠色熒光蛋白，但是為了確定攜帶的premiR-29b-3p是否可以加工成成熟的miR-29b-3p及檢測其表達水平，通過qRT-PCR檢測到miR-29b-3p的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-29b-3p表達增強，表明構建的腺相關病毒成功感染腦組織并使miR-29b-3p表達增加。

目前在精神疾病方面通過AAV載體的基因治療已經(jīng)有很多報道，BAI[16]研究證明AAV-proBDNF感染大鼠海馬可以上調(diào)抑郁樣大鼠海馬BDNF的水平，MARONGIU[17]通過AAV-sh-p11阻斷P11基因的表達治療帕金森大鼠，但是沒有腺相關病毒攜帶miR基因治療抑郁癥的相關文獻，本研究制備的rAAV-miR-29b-3p感染抑郁癥模型大鼠前額葉皮質(zhì)后，抑郁癥大鼠行為學出現(xiàn)改變（數(shù)據(jù)未顯示），這將為進一步研究miR-29b-3p的生理學功能以及抑郁癥的基因治療提供有效的手段與方法。

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（張蕾 編輯）

Construction of recombinant adeno-associated virus expressing miRNA-29b-3p and its expression in prefrontal cortex of rats*

Mao Li,Jian-guo Feng,Xiao-bin Wang,Qian-xiu Chen,Yun-qiang Wan
(Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To obtain the recombinant adeno-associated virus expressing miRNA-29b-3p(rAAV-miRNA-29b-3p),and examine the infection effect and expression level of rAAV-miRNA-29b-3p in the prefrontal cortex of rats.Methods The pre-miRNA-29b-3p gene fragment was inserted into AAV expression plasmid to construct a recombinant AAV plasmid.The recombinant AAV plasmid,packaging plasmid and helper plasmid were co-transfected into HEK293 cells by LipofiterTMfor rAAV-miRNA-29b-3p packaging.The rAAV-miRNA-29b-3p was harvested from transfected HEK293 cells and purified by a resin column,and the titer of the rAAV-miRNA-29b-3p was tested by qRT-PCR.The rAAV-miRNA-29b-3p was injected to the prefrontal cortex of rats using stereotactic apparatus.The infection effect was observed under immunofluorescence microscope,the expression level of miRNA-29b-3p was detected by qRT-PCR.Results High titer of rAAV-miRNA-29b-3p was obtained after successful packaging.The rAAV-miRNA-29b-3p was purified,the virus titer reached 1.0×1012vg/ml.Strong green fluorescence and high level of miRNA-29b-3p were detected in the infected prefrontal cortex after 21 days of infection.Conclusions The constructed rAAV-miRNA-29b-3p can greatly increase the expression level of miRNA-29b-3p in the prefrontal cortex of rats,which provides a useful tool for further study of the biological function of miRNA-29b-3p.

adeno-associated virus;miRNA-29b-3p;prefrontal cortex;rat

R338；R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.001

1005-8982（2017）25-0001-07

2016-12-24

國家自然科學基金（No：81271478）

王曉斌，E-mail：wangxiaobin67@163.com；Tel：13708280087