閆李俠，黃至澄，任應(yīng)鵬，李恪梅，陳保文，王國治

噬菌體治療泛耐藥鮑氏不動桿菌重癥感染小鼠的研究

閆李俠1，黃至澄1，任應(yīng)鵬1，李恪梅2，陳保文2，王國治2

目的探討噬菌體治療泛耐藥鮑氏不動桿菌重癥感染小鼠的療效。方法以SPF級昆明小鼠建立小鼠感染泛耐藥鮑氏不動桿菌的模型，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組使用噬菌體AB46治療，對照組給同等體積的肉湯治療，統(tǒng)計(jì)比較兩組小鼠的生存率，進(jìn)行脾菌數(shù)分析。結(jié)果泛耐藥鮑氏不動桿菌1∶10稀釋實(shí)驗(yàn)組與對照組P=0.020<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1∶2、1∶5稀釋組分別為P=0.650，P=0.170，均>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1∶50稀釋的實(shí)驗(yàn)組與對照組均無小鼠死亡，脾菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果P=0.026，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論噬菌體治療泛耐藥鮑氏不動桿菌重癥感染小鼠是一種有效的治療方法，可明顯提高小鼠的生存率，在感染較輕的情況下可以明顯降低小鼠的脾菌數(shù)。

噬菌體；治療；鮑曼不動桿菌；感染

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種條件致病菌[1]，所致的感染常見于重癥感染的患者[2-4]，但是近年來鮑曼不動桿菌已經(jīng)導(dǎo)致各種情況的耐藥，并出現(xiàn)了全耐藥的鮑曼不動桿菌[5-7]，一旦感染其后果相當(dāng)嚴(yán)重，而當(dāng)前的治療方法僅能采用多粘菌素進(jìn)行治療[8]，但是多粘菌素的腎毒性很大，治療效果不理想，目前已經(jīng)在多個國家禁止使用[9-10]。本文以昆明小鼠建立全耐藥鮑曼不動桿菌的重癥感染模型，從醫(yī)院污水中獲得的噬菌體治療之。

1 材料與方法

1.1主要試劑及實(shí)驗(yàn)器材 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(由中國藥品生物制品檢定所培養(yǎng)基室提供)。1 mL、5 mL、10 mL一次性使用無菌注射器，上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司；微型離心機(jī)，德國eppendorf公司；0.2 μm一次性使用無菌過濾器，美國Pall公司；微量移液器，德國BRAND公司；微量移液器槍頭，美國AXYGEN公司。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 選用健康的6～8周齡(體重20 g左右)SPF級昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，所有小鼠由中國藥品生物制品鑒定研究院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。泛耐藥鮑氏不動桿菌A46由中國藥品生物制品鑒定研究院抗生素室提供，鮑氏不動桿菌裂性噬菌體AB46為本實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得。

1.3重癥感染模型建立 將泛耐藥鮑氏不動桿菌A46加入少量于大管肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃培箱培養(yǎng)18 h，再將此菌液鋪于大管斜面營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)16 h，用無菌生理鹽水將其洗下，稀釋至不同倍數(shù)，用比濁法確定濃度，并同時(shí)用菌落計(jì)數(shù)法測定其活菌數(shù)。將不同稀釋倍數(shù)的泛耐藥鮑氏不動桿菌A46各取0.5 mL注射于5組SPF級昆明小鼠的腹腔內(nèi)(每組10只，雌雄各半)，觀察7 d，選擇導(dǎo)致一組小鼠全部死亡的最小劑量[6]作為絕對致死量(LD100)。用此劑量(每只小鼠0.5 mL菌A46)建立重癥感染模型，發(fā)現(xiàn)重癥感染泛耐藥鮑氏不動桿菌的小鼠往往在24 h內(nèi)全部死亡。為了同時(shí)了解感染程度較輕的情況下噬菌體的治療效果，同時(shí)采用了不同稀釋倍數(shù)的劑量作為另外幾組小鼠的感染劑量。

1.4噬菌體的治療效果分析 設(shè)定5個大組，每大組20只，做為不同濃度泛耐藥鮑氏不動桿菌感染小鼠的劑量組，每大組隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。各大組分別采用不同濃度泛耐藥鮑氏不動桿菌感染小鼠，泛耐藥鮑氏不動桿菌A46以5×1010cfu/mL為最高濃度，按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50稀釋為5個梯度，所有小鼠腹腔注射劑量均是0.5 mL。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射泛耐藥鮑氏不動桿菌A46之后，使用效價(jià)為5×108的噬菌體AB46 0.5 mL腹腔注射治療，對照組小鼠則不注射噬菌體，而注射等量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，觀察小鼠生存情況并記錄。于7 d后將未出現(xiàn)小鼠死亡大組的小鼠全部處死，然后取小鼠脾臟研磨，將實(shí)驗(yàn)組及對照組小鼠脾臟皆用10 mL無菌生理鹽水研磨溶解后取100 μL，再按1∶10稀釋后從中取100 μL鋪于瓊脂平皿中行菌落計(jì)數(shù)，由于所有小鼠均采用此方法稀釋，最后統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)直接處理平皿中的菌落數(shù)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 小鼠的生存率數(shù)據(jù)采用Fisher確切概率法，小鼠脾菌數(shù)資料采用配對t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件使用SPSS13.0。

2 結(jié) 果

2.1絕對致死量 經(jīng)過反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)梯度稀釋的菌液每只0.5 mL注射小鼠后，1010cfu/mL及更高濃度的菌液可導(dǎo)致一組小鼠24 h內(nèi)全部死亡，死亡時(shí)間大多數(shù)在12 h之內(nèi)，因此確定泛耐藥鮑氏不動桿菌A46 1010cfu/mL，0.5 mL為小鼠致死劑量，此劑量感染的小鼠模型為重癥感染模型。

2.2小鼠生存分析 泛耐藥鮑氏不動桿菌A46以5×1010cfu/mL為最高濃度，依次按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50稀釋，噬菌體治療一次后觀察療效7d，發(fā)現(xiàn)并非所有小鼠可免于死亡。其中1∶2稀釋組的實(shí)驗(yàn)組10只，生存5只死亡5只；對照組10只，生存3只死亡7只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.650>0.05)。1∶5稀釋組的實(shí)驗(yàn)組10只，生存6只死亡4只；對照組10只生存2只死亡8只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.170>0.05)，說明這兩組小鼠感染較重，噬菌體治療無明顯效果。但1∶10稀釋組的實(shí)驗(yàn)組10只生存9只死亡1只，對照組10只生存3只死亡7只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=0.020<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組和對照組有區(qū)別，噬菌體治療效果顯著。1∶50稀釋組，實(shí)驗(yàn)組與對照組各10只，均無小鼠死亡，說明噬菌體感染較輕時(shí)，小鼠生存率不受影響。

2.3小鼠脾菌數(shù) 1∶100稀釋組脾臟落計(jì)數(shù)僅有1只實(shí)驗(yàn)組小鼠菌落計(jì)數(shù)為1，其余小鼠菌落計(jì)數(shù)為0，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于1∶2、1∶5、1∶10稀釋組均有小鼠死亡，不進(jìn)行脾菌數(shù)計(jì)數(shù)。1∶50稀釋組無小鼠死亡，進(jìn)行脾菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=0.026<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，接受噬菌體治療組的小鼠脾臟菌落計(jì)數(shù)明顯少于未治療組，進(jìn)一步證實(shí)噬菌體治療效果顯著。

表1 小鼠脾菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果
Tab.1 Count number of spleen count in mice

小鼠mice12345678910實(shí)驗(yàn)組Experiencegroup1311111113對照組Controlgroup133537535934922541

注：1∶50稀釋組，P=0.026<0.05

Note：1∶50 dilution group,P=0.026<0.05

3 討 論

鮑氏不動桿菌感染常見于重癥感染患者，雖然本身是條件致病菌，但是目前耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，并且已經(jīng)出現(xiàn)泛耐藥的鮑氏不動桿菌。因而，噬菌體治療的研究重新受到重視。

本研究以不同劑量的泛耐藥鮑氏不動桿菌感染小鼠，采用統(tǒng)一效價(jià)的噬菌體治療，在一定的感染程度下，療效是值得肯定的。但是噬菌體并不能保證所有被感染的小鼠存活，這與感染嚴(yán)重程度密切相關(guān)，當(dāng)感染非常嚴(yán)重時(shí)，治療與不治療已經(jīng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與人類疾病發(fā)展的自然規(guī)律極為相似，臨床上嚴(yán)重的感染，再有效的藥也不可能使100%的病人免于死亡。再者，泛耐藥鮑氏不動桿菌，雖是條件致病菌，但感染劑量大時(shí)很容易導(dǎo)致無基礎(chǔ)疾病的小鼠很快死亡，死亡速度非?？?，通常在12h內(nèi)。當(dāng)感染的菌量太小時(shí)，無論治療與否，小鼠的生存都不會受到影響。此外，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鮑氏不動桿菌一旦導(dǎo)致小鼠的重癥感染，噬菌體治療后，存活而且脾菌數(shù)顯示有菌的小鼠其生存狀況都比較好，人為觀察下看不出有菌和無菌小鼠的區(qū)別，這也許與觀察時(shí)間不夠長有關(guān)，在以后的研究中將會延長觀察時(shí)間。

鮑曼不動桿菌感染有其自身的特點(diǎn)，噬菌體在一定條件下的確有保護(hù)宿主不受感染的能力，但是目前主要問題是裂解譜窄，提高效價(jià)比較困難，一方面需要更大量地尋找寬噬噬菌體，另一方面可以通過改造噬菌體的基因來解決。但同時(shí)噬菌體由于其生物學(xué)特性的特殊性，與抗生素相比無半衰期的限制，可能只需使用一次，只要宿主菌存在，它在體內(nèi)可以自動增殖，不斷裂解宿主菌。并且噬菌體高度專一，只破壞相對應(yīng)的一種宿主菌，對人體內(nèi)正常菌群無影響，這些絕對的優(yōu)勢，是它又被重新重視的重要原因。此外，噬菌體用作藥物還需要長期毒性、異毒性及致畸作用等方面的全面更深入的研究。

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ThetreatmentofsevereinfectionofmicecausedbypandrugresistantAcinetobacterbaumanniiwithbacteriophages

YAN Li-xia1, HUANG Zhi-cheng1, REN Ying-pen1, LI Ke-mei2, CHEN Bao-wen2,WANG Guo-zhi2

(1.TaizhouCityfristHospitalofZhengjianProvince,Taizhou318020,China;2.InstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProductsBeijing100050,China)

We explored the effect of therapy with bacteriophages for pandrug resistantAcinetobacterbaumanniiinfections. Kunming mice (Specific Pathogen Free) were divided into two groups: experimental group (severe infection caused by pandrug resistantAcinetobacterbaumannii) and the control group. The mice of experimental group were treated with Phages AB46 while the mice of control group were treated with broth. The survival rate was compared with statistical method and the spleen bacteria count was analyzed. Results showed that there were statistical difference between the experimental group and control group of Pandrug resistantAcinetobacterbaumanniigroups of 1∶10 dilution,P=0.020<0.05. There were no statistical difference between each two groups of 1∶2 (P=0.650) and 1∶5 (P=0.170) dilution, both were>0.05. There were no dead mice in groups of 1∶50 dilution with statistical difference of spleen bacteria count,P=0.026. Therapy with phages was an effective method to control infection caused by Pandrug resistantAcinetobacterbaumanniiwhich could increase the survival rate and decrease spleen bacteria count of the mice with light infection.

bacteriophage; treatment;Acinetobacterbaumannii; infection

Wang guo-zhi，Email: tbtestlab@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.014

王國治，Email：tbtestlab@126.com

1.浙江省臺州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，臺州 318020；

2.中國藥品生物制品檢定研究院，北京 100050

378

A

1002-2694(2017)10-0920-03

2017-06-23編輯李友松