周苗苗+崔景香

摘要：為研究不同二肽對奶牛乳腺組織中乳蛋白合成的影響，在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織培養(yǎng)液中分別添加不同的賴氨酸二肽：賴氨酸-賴氨酸（Lys-Lys）、賴氨酸-組氨酸（Lys-His）、賴氨酸-苯丙氨酸（Lys-Phe）、賴氨酸-亮氨酸（Lys-Leu）和賴氨酸-蘇氨酸（Lys-Thr），等量取代培養(yǎng)液中10%游離賴氨酸（賴氨酸總濃度為210 μg/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，試驗結(jié)束后收集乳腺組織和培養(yǎng)液分別檢測基因表達(dá)和乳蛋白合成。結(jié)果表明，同游離Lys和Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His二肽相比，Lys-Leu和Lys-Phe顯著提高了乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達(dá)（P<0.05）；5種肽結(jié)合Lys均顯著提高了小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（PepT2）的mRNA豐度（P<0.05），Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)（P<0.05）。說明小肽不同的氨基酸組成可影響奶牛小肽的攝取和乳蛋白的合成，同親水性氨基酸組成的小肽相比，疏水性氨基酸組成的小肽更能促進(jìn)乳腺αs1酪蛋白基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：小肽；氨基酸；賴氨酸二肽；乳蛋白；小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2；奶牛乳腺組織；豐度；αs1酪蛋白基因

中圖分類號： S823.9+11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0166-02

收稿日期：2016-04-29

基金項目：山東省濰坊市科技發(fā)展計劃（編號：2015GX077）。

作者簡介：周苗苗（1983—），女，山東聊城人，博士，副教授，主要從事反芻動物泌乳生理研究。E-mail：zhoumm0329@163.com。 乳腺組織能攝取血液循環(huán)中的小肽（2～3個氨基酸組成）作為乳蛋白合成的前體物質(zhì)，小肽在反芻動物乳腺蛋白合成中發(fā)揮重要作用[1-2]。很多研究證實，給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的必需氨基酸如蛋氨酸（methionine，Met）、賴氨酸（lysine，Lys）、纈氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、蘇氨酸（threonine，Thr），小肽均能促進(jìn)酪蛋白的基因表達(dá)和乳蛋白合成[3-9]。目前關(guān)于小肽添加量對乳蛋白合成的影響研究較多，而小肽的氨基酸組成對乳蛋白合成影響的研究較少。因此，本試驗初步探討了不同氨基酸組成的含Lys二肽對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織乳蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)

取泌乳中期的中國荷斯坦奶牛乳腺組織，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。將組織塊種植于6孔板上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2），待組織貼壁后每孔添加2 mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM（dulbeccos modified eagles medium）-F12（Gibco，美國）添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL 胰島素（Sigma，美國）、500 ng/mL催乳素（Sigma，美國）、1 μg/mL氫化可的松（Sigma，美國）以及10%胎牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗處理培養(yǎng)液中去除胎牛血清、補(bǔ)充幾種必需氨基酸[Phe、Met、Lys、Leu、Val、異亮氨酸（isoleucine，Ile）、蘇氨酸（threonine，Thr）、組氨酸（histidine，His）]，并按試驗設(shè)計調(diào)整相應(yīng)氨基酸和小肽的濃度。分別用培養(yǎng)液中Lys總量（210 μg/mL）10%肽結(jié)合Lys[Lys-Lys/（LL）、Lys-His/（LH）、Lys-Phe/（LP）、Lys-Leu/（LU）、Lys-Thr/LT]替代等量的Lys。試驗處理48 h后，分別收集乳腺組織和培養(yǎng)液用于總RNA提取和總蛋白含量測定。每個處理重復(fù)3次。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Trizol（Invitrogen，美國）提取組織中的總RNA。RNA純度以紫外吸光法檢測（D260 nm/D280 nm>1.80）。抽提的RNA溶解后立即用于第1鏈cDNA的合成（PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa）。合成的cDNA貯存于-20 ℃，備用。

1.4 實時熒光定量PCR（real-time PCR）

采用實時熒光定量PCR方法檢測mRNA的表達(dá)。αs1酪蛋白、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（oligopeptide transporter 2，PepT2）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的實時熒光定量專用引物見表1。PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為2 μL cDNA模板+18 μL PCR反應(yīng)液（SYBR Premix Ex TaqTM Real Time PCR試劑盒，TaKaRa）。純水替代cDNA模版作為陰性對照。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，40個循環(huán)；60 ℃ 34 s。ABI7 500實時定量序列檢測軟件（Applied Biosystems，美國）自動讀取循環(huán)數(shù)（CT）值，GAPDH、αs1酪蛋白和PepT2的擴(kuò)增效率分別為100.9%、100.1%、101.3%，mRNA相對變化值用公式2-ΔΔCT進(jìn)行計算。

1.5 DNA總量和培養(yǎng)液中總蛋白質(zhì)含量測定

用Trizol提取組織中的DNA總量，用紫外吸光度法測定DNA的純度（D260 nm/D280 nm>1.80）和含量。DNA含量作為“組織數(shù)量/細(xì)胞數(shù)量”的代表，用于校正培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)

含量。將冷的丙酮沉淀培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)溶于含1 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，隨后根據(jù)Bradford的方法[9]用蛋白質(zhì)檢測試劑盒（博士德，武漢）檢測培養(yǎng)液中的總蛋白質(zhì)含量，并以此代表培養(yǎng)液中的乳蛋白含量。以試驗組DNA校正乳蛋白含量[蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）同DNA質(zhì)量（μg）的比值]同對照組DNA校正乳蛋白含量的比值作為最終結(jié)果進(jìn)行比較。endprint

1.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，用SAS軟件 PROC-GLM 程序進(jìn)行統(tǒng)計分析。當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

同游離Lys和其他Lys二肽相比，Lys-Leu、Lys-Phe可顯著提高乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達(dá)（P<0.05），其中Lys-Phe組αs1酪蛋白mRNA豐度最高（圖1-A）。同對照組相比，Lys二肽替代組乳蛋白合成量差異不顯著（圖1-B）。

5種肽結(jié)合Lys的添加均顯著提高了PepT2的mRNA豐度（P<0.05，圖2）。不同氨基酸殘基組成的小肽對PepT2基因表達(dá)的影響不同。由圖2可見，Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個復(fù)雜的過程，影響因素較多。除肽鏈長度外，肽的氨基酸殘基組成是影響肽吸收的另一個重要因素。一般而言，L型氨基酸組成的小肽要比D型氨基酸組成的小肽更易吸收；中性氨基酸組成的小肽比酸堿性氨基酸組成的小肽更易被動物吸收。在本試驗中，同Lys-His、Lys-Thr、Lys-Lys相比，Lys-Leu、Lys-Phe顯著增加了乳腺組織中αs1酪蛋白mRNA豐度（P<0.05）。分析小肽的氨基酸組成可以發(fā)現(xiàn)，同親水性和帶電荷的氨基酸殘基（如Thr、Lys和His）組成的小肽相比，疏水性和體積較大的氨基酸殘基（如Phe和Leu）組成的小肽更能促進(jìn)乳腺中αs1酪蛋白的基因表達(dá)和乳蛋白合成。這些結(jié)果表明，小肽在促進(jìn)乳蛋白合成方面的效果受其氨基酸組成的影響。

小肽的吸收主要依賴于小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)。哺乳動物體內(nèi)主要的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括PepT1和PepT2。在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中則僅有PepT2表達(dá)[7]。這些肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)小肽，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)與肽結(jié)構(gòu)類似的藥物。與氨基酸（AA）轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不同，小肽是逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)，而且主要依賴H+或Ca2+濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。與游離氨基酸（FAA）吸收慢、吸收時耗能高相比，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低等特點。小肽與FAA相互獨(dú)立的吸收機(jī)制，有助于減輕由于FAA相互競爭共同吸收位點而產(chǎn)生的吸收抑制。小肽載體對底物具有廣泛的適應(yīng)性，幾乎能夠轉(zhuǎn)運(yùn)所有的二肽和三肽[10]。但肽載體對底物構(gòu)象具有嚴(yán)格的特異性，它對N末端含D型AA的耐受性比C末端為D型的高，而全D型的肽不能作為底物。另外，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體對由疏水性和體積較大的氨基酸殘基組成的小肽具有高親和力；而對由親水性和帶電荷的氨基酸殘基組成的小肽親和力較低[11]。本試驗中5種肽結(jié)合Lys的添加均顯著提高了PepT2的mRNA豐度（P<0.05）。PepT2是一種底物親和力高，但易飽和的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾樱瑫r乳腺組織又有攝取小肽的需求時，只能通過增加PepT2的數(shù)量來實現(xiàn)。PepT2在奶牛乳腺小肽攝取過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其蛋白數(shù)量同其轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的多少呈正相關(guān)關(guān)系[6，12]。因此，PepT2的表達(dá)增強(qiáng)也說明了乳腺對小肽的攝取增加。此外，不同氨基酸殘基組成的賴氨酸小肽對PepT2基因表達(dá)的影響不同。Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His更能促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)（P<005）。這一結(jié)果同Lys-Phe和Lys-Leu對αs1酪蛋白的基因表達(dá)影響結(jié)果一致。以上結(jié)果說明，小肽不同的氨基酸殘基組成可以影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞小肽的攝取，進(jìn)而影響乳蛋白的合成。

Lys-Lys、Lys-His、Lys-Leu、Lys-Phe、Lys-Thr對奶牛乳腺組織乳蛋白合成的促進(jìn)作用依賴于其氨基酸殘基的理化性質(zhì)。同親水性氨基酸組成的小肽相比，疏水性氨基酸組成的小肽更能促進(jìn)乳腺αs1酪蛋白基因的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tagari H，Webb K，Theurer B，et al. Mammary uptake，portal-drained visceral flux，and hepatic metabolism of free and peptide-bound amino acids in cows fed steam-flaked or dry-rolled sorghum grain diets[J]. Journal of Dairy Science，2008，91（2）：679-697.

[2]Mabjeesh S J，Kyle C E，MacRae J C，et al. Vascular sources of amino acids for milk protein synthesis in goats at two stages of lactation[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（4）：919-929.

[3]Wang S. Peptide-bound methionine can be a source of methionine for the synthesis of secreted proteins by mammary tissue explants from lactating mice[J]. The Journal of Nutrition，1996，126（6）：1662.

[4]Pan Y，Bender P K，Akers M，et al. Methionine-containing peptides can be used as methionine sources for protein accretion in cultured C2C12 and MAC-T cells[J]. The Journal of Nutrition，1996，126（1）：232.endprint

[5]Wu H H，Yang J Y，Zhao K. Effects of methionine-containing dipeptides on casein αs1 expression in bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of Animal Feed Science，2007，16（S2）：7-12.

[6]Zhou M M，Wu Y M，Liu H Y，et al. Role of oligopeptide transporter 2 in bovine mammary gland phenylalanine dipeptide uptake[J]. Chin Anim Nutr，2011，23（8）：1303-1308.

[7]Zhou M M，Wu Y M，Liu H Y，et al. Effects of tripeptide and lactogenic hormones on oligopeptide transporter 2 in bovine mammary gland[J]. J Anim Physiol An N，2011，95（6）：781-789.

[8]Zhou M M，Wu Y M，Liu H Y，et al. Effects of phenylalanine and threonine oligopeptides on milk protein synthesis in cultured bovine mammary epithelial cells[J]. J Anim Physiol An N，2015，99（2）：215-220.

[9]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem，1976，72（1-2）：248-254.

[10]Daniel H，Kottra G. The proton oligopeptide cotransporter family SLC15 in physiology and pharmacology[J]. Pflügers Archiv，2004，447（5）：610-618.

[11]Matthews D M. Protein absorption[M]. New York：Development and Present State of the Subject，1991.

[12]Takahashi K，Masuda S，Nakamura N，et al. Upregulation of H+-peptide cotransporter PepT2 in rat remnant kidney[J]. American Journal of Physiology （Renal Physiology），2001，281（6）：1109-1116.楊紅洋，朱曉慶，商云霞，等. 中藥復(fù)方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型雞新城疫抗體和免疫球蛋白IgG、IgM含量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：168-172.endprint