郭芳+劉海鵬+李保國(guó)+張雪梅+齊國(guó)輝+李迎超+張玲+許洋

摘要：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合（BBD）試驗(yàn)原理，選取6-BA濃度、光照度、增殖周期為試驗(yàn)因素，以增殖系數(shù)為響應(yīng)值，采取3因素3水平響應(yīng)面法進(jìn)行回歸模型分析，以優(yōu)化紅樹(shù)莓組培苗增殖的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，以無(wú)透氣孔的塑料蓋為封口材料，紅樹(shù)莓組培苗增殖的最佳培養(yǎng)條件為6-BA 1.59 mg/L、光照度 1 391 lx、增殖周期42 d，在此條件下紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)預(yù)測(cè)值為10.950，驗(yàn)證得到的實(shí)際值為11.019。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；培養(yǎng)條件；紅樹(shù)莓；增殖系數(shù)；光照度；增殖周期

中圖分類號(hào)： S663.204+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0056-04

收稿日期：2016-04-17

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：16226806D）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果惠民示范工程 （編號(hào)：Z141100002314009）。

作者簡(jiǎn)介：郭 芳（1990—），女，河北盧龍人，碩士研究生，從事經(jīng)濟(jì)林栽培生理研究。E-mail：guofang901003@163.com。

通信作者：李保國(guó)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培生理和山區(qū)開(kāi)發(fā)技術(shù)研究及經(jīng)濟(jì)林栽培教學(xué)工作。E-mail：13582620586@163.com。 紅樹(shù)莓（Rubus idaeus L.）為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉灌木，別稱覆盆子、馬林、托盤等，果實(shí)為聚合果，富含果糖、維生素、氨基酸等，風(fēng)味香醇，酸甜可口，在世界上被譽(yù)為“黃金水果”，具有防癌、抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛、抗血凝等保健藥用功能，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于化妝、醫(yī)藥、食品、保健等領(lǐng)域，成為最具潛力的第3代新興保健水果[1-2]。發(fā)展紅樹(shù)莓，大量的優(yōu)質(zhì)苗木是關(guān)鍵。目前，紅樹(shù)莓苗木生產(chǎn)主要依靠根蘗繁殖，不僅繁殖系數(shù)低、速度慢，而且連續(xù)根孽繁殖會(huì)造成品種退化，易通過(guò)苗木傳播土壤病蟲(chóng)害。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行紅樹(shù)莓脫毒快繁是快速繁育優(yōu)良苗木的最佳途徑，我國(guó)已在獼猴桃、棗樹(shù)、草莓等樹(shù)種上建立了相關(guān)的繁育體系[3-5]。對(duì)于紅樹(shù)莓，前人的研究大多集中在最佳培養(yǎng)基篩選[6-10]，而對(duì)其培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究尚無(wú)報(bào)道。

6-BA為人工合成的細(xì)胞分裂素類化合物，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞分裂、調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、促進(jìn)植物新陳代謝等[11]。光強(qiáng)直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)特征，而封口材料則會(huì)影響培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的通氣性，進(jìn)而影響容器內(nèi)濕度及氣體與外界的交換。響應(yīng)面分析法作為一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可以精確表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，現(xiàn)已被廣泛用于多因素影響的試驗(yàn)優(yōu)化上。本研究在6-BA、光照度、封口方式及增殖周期等單因素對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖影響試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以確立紅樹(shù)莓組織培養(yǎng)育苗技術(shù)體系，為紅樹(shù)莓組織培養(yǎng)工廠化育苗提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為“海爾特茲”紅樹(shù)莓繼代組培苗1 cm左右的帶芽莖段。MS基本培養(yǎng)基，其蔗糖含量為30 g/L，瓊脂為 5 g/L，高壓滅菌前pH 值為5.8。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 6-BA濃度對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 光照度2 000 lx、增殖周期30 d、封口方式選擇無(wú)透氣孔的塑料蓋，設(shè)定6-BA處理濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。

1.2.1.2 光照度對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 6-BA 1.0 mg/L、增殖周期30 d、封口方式選擇無(wú)透氣孔的塑料蓋，設(shè)定光照處理強(qiáng)度分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500 lx。

1.2.1.3 增殖周期對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 6-BA 1.0 mg/L、光照度2 000 lx、封口方式選擇無(wú)透氣孔的塑料蓋，設(shè)定增殖處理周期分別為30、40、50、60 d。

1.2.1.4 封口方式對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 6-BA 1.0 mg/L、光照度2 000 lx、增殖周期30 d，設(shè)定封口處理方式分別為無(wú)透氣孔的塑料蓋、普通封口膜。

1.2.2 紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化 采用響應(yīng)面分析法，根據(jù)中心組合試驗(yàn)（BBD）設(shè)計(jì)原理，確定6-BA、光照度、增殖周期3個(gè)因素作為中心組合試驗(yàn)因子（表1），增殖系數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015年8—10月在河北省南和縣河北至高點(diǎn)農(nóng)業(yè)科技有限公司組培中心進(jìn)行，選用容積為240 mL的培養(yǎng)瓶，每瓶接入7個(gè)紅樹(shù)莓莖段，均勻分布；各試驗(yàn)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理20瓶，重復(fù)5次；培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)30 d，調(diào)查其增殖系數(shù)，培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃，濕度（50±5）%，光周期14 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用LSD法及Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 6-BA濃度對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 由表3可知，隨培養(yǎng)基中6-BA濃度的升高，紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)逐漸增加，6-BA濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)增殖系數(shù)達(dá)到最大，為5.267；當(dāng)6-BA濃度增加到2.0 mg/L時(shí)，紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)反而減小，說(shuō)明6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)紅樹(shù)莓組培苗的增殖生長(zhǎng)受到抑制。因此，紅樹(shù)莓組培苗增殖的最適6-BA濃度為1.5 mg/L。

2.1.2 光照度對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 由表3可知，隨光照度的增加，紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)逐漸增加，光照度達(dá)到1 500 lx時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最大，為6.419；當(dāng)光照度增加到2 000 lx時(shí)，紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)反而減小，說(shuō)明當(dāng)光照度超過(guò)2 000 lx 時(shí)，紅樹(shù)莓組培苗的增殖生長(zhǎng)受到抑制。因此，紅樹(shù)莓組培苗增殖的最適光照度為 1 500 lx。endprint

2.1.3 增殖周期對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 由表3可知，隨增殖周期由30 d延長(zhǎng)到40 d，紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)逐漸增加，增殖系數(shù)達(dá)到6.962，

2.1.4 封口方式對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響 由表3可知，以無(wú)透氣孔塑料蓋為封口材料的紅樹(shù)莓組培苗，其增殖系數(shù)顯著優(yōu)于普通封口膜（P<0.05），且以普通封口膜為封口材料的紅樹(shù)莓組培苗明顯發(fā)黃，甚至發(fā)生死亡，這一方面可能是由于普通封口膜完全將培養(yǎng)瓶密封，而塑料蓋與培養(yǎng)瓶之間為螺旋狀連接，增加了容器的透氣性，培養(yǎng)過(guò)程中CO2得到補(bǔ)充，從而提高了組培苗的光合自養(yǎng)能力，進(jìn)而影響其增殖，另一方面可能是光透過(guò)普通封口膜后被吸收或反射了利于紅樹(shù)莓組培苗進(jìn)行光合作用的光譜，使其凈光合速率降低。因此，增殖的最適封口方式為無(wú)透氣孔的塑料蓋。

2.2 紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果回歸分析 根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，以6-BA（X1）、光照度（X2）、增殖周期（X3）為自因素，以增殖系數(shù)（Y）為響應(yīng)值，得回歸方程模型為Y=-42.607 86+9.666 19X1+0.015 516X2+1.671 83X3+0.000 9X1X2+0.022 857X1X3+0000 06X2X3-3.746 67X12-0.000 007X22-0021 367X32（R2=0.994 0），該回歸擬合模型經(jīng)方差檢驗(yàn)達(dá)到極顯著水平（表4），響應(yīng)值的變化有99.40%來(lái)源于所選自變量；該模型決定系數(shù)R2=0.994 0與決定系數(shù)R2Adj=0986 3相近，表明該方程與數(shù)據(jù)擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用于對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖情況的分析預(yù)測(cè)。由表4可見(jiàn)，6-BA濃度、光照度、增殖周期的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)變化對(duì)紅樹(shù)莓組培苗的增殖有極顯著影響，光照度和增殖周期交互項(xiàng)對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖有顯著影響，而6-BA和光照度、6-BA和增殖周期交互項(xiàng)對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響不顯著，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P=0.109 3>0.05，說(shuō)明試驗(yàn)無(wú)其他顯著因素的影響，可信度比較高[12]。

2.2.2 響應(yīng)面分析 通過(guò)多元回歸方程所作響應(yīng)面曲線圖及等高線圖可以直觀地反映6-BA濃度、光照度和增殖周期對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響。由圖1、圖2、圖3可見(jiàn)，增殖周期對(duì)紅樹(shù)莓組培苗增殖的影響最為明顯，曲線面最陡；其次是光照度，曲線面較陡；影響作用最小的是6-BA濃度，曲線面趨于平緩；各因素所選范圍內(nèi)均存在極值點(diǎn)；光照度和增殖周期的交互作用顯著，6-BA和光照度、6-BA和增殖周期的交互作用不顯著。

2.2.3 模型方程的驗(yàn)證 通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件求出回歸模型的極值點(diǎn)，得到以無(wú)透氣孔塑料蓋為封口材料時(shí)紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)的最優(yōu)條件為6-BA 1.59 mg/L、光照度1 390.81 lx、增殖周期41.97 d，此條件下增殖系數(shù)理論值為10.950。驗(yàn)證試驗(yàn)培養(yǎng)條件調(diào)整為6-BA 1.59 mg/L、光照度1 391 lx、增殖周期42 d，重復(fù)3次，得到增殖系數(shù)真實(shí)平均值為11.019，與理論預(yù)測(cè)值非常相近，這說(shuō)明該模型可信，響應(yīng)面法可用于紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)的最適 6-BA濃度為1.5 mg/L、光照度為1 500 lx、增殖周期為 40 d，以無(wú)透氣孔塑料蓋對(duì)容器進(jìn)行封口。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)BBD中心組合試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到紅樹(shù)莓組培苗增殖的最佳綜合培養(yǎng)條件為6-BA 1.59 mg/L、光照度 1 391 lx、增殖周期42 d，此時(shí)紅樹(shù)莓組培苗的增殖系數(shù)理論值為10950，實(shí)際驗(yàn)證增殖系數(shù)為11.019，兩者高度接近，說(shuō)明響應(yīng)面法用于紅樹(shù)莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化是可靠的。

6-BA是一種細(xì)胞分裂素，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂，但濃度過(guò)高則會(huì)抑制芽的發(fā)生。本研究中，當(dāng)6-BA濃度大于1.5 mg/L時(shí)，紅樹(shù)莓組培苗的增殖開(kāi)始受到抑制，而其影響紅樹(shù)莓生長(zhǎng)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。封口方式對(duì)組培苗的增殖會(huì)產(chǎn)生影響，封口方式不同使容器內(nèi)外的氣體交換產(chǎn)生差異，從而對(duì)培養(yǎng)容器中氣體組成[13]、芽伸長(zhǎng)、溫度、濕度及增殖等產(chǎn)生影響[14-15]。Tsuro等試驗(yàn)表明，透氣狀況的改善可提高增殖培養(yǎng)的效率[16-17]。本試驗(yàn)中選擇無(wú)透氣孔的塑料蓋進(jìn)行封口，對(duì)紅樹(shù)莓組培苗的增殖效果要顯著好于普通封口膜，除由于透氣不同外，也可能是光透過(guò)普通封口膜后，被吸收或反射了有利于紅樹(shù)莓組培苗進(jìn)行光合作用的光譜，使其凈光合速率降低，從而導(dǎo)致增殖率降低，具體原因也有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于培養(yǎng)條件的優(yōu)化，主要方法有單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)法、響應(yīng)面法等。單因素試驗(yàn)常用于確定某一因素的使用范圍，方法簡(jiǎn)單、容易，結(jié)果明了，但忽略組分間的交互作用，可能會(huì)完全丟失最適宜的條件；正交試驗(yàn)法雖研究多因素、多水平的組合，但只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，并不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式；響應(yīng)面法采用多元二次回歸模型擬合各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，試驗(yàn)數(shù)少、周期短、回歸方程精度高，并能克服正交試驗(yàn)只能處理離散水平值，而無(wú)法找出最佳組合和響應(yīng)值的缺陷[18]。近幾年，響應(yīng)面法在食品學(xué)、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[19-22]。本試驗(yàn)選取6-BA濃度、光照度、增殖周期3個(gè)因素，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紅樹(shù)莓組培苗的增殖培養(yǎng)條件并獲得成功，為紅樹(shù)莓組織培養(yǎng)的工廠化育苗提供了一定的理論支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]賀立恒. 美國(guó)紅樹(shù)莓和黑莓脫毒快繁及工廠化育苗研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[2]尹相博，于詠梅，于立芝. 紅樹(shù)莓組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（2）：140-143.

[3]劉 崢，張?zhí)?，張漢堯. 獼猴桃組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀與展望[J]. 福建林業(yè)科技，2013，40（4）：231-235.endprint

[4]金 琪. 棗樹(shù)再生體系的建立及離體加倍的初步研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2014.

[5]劉 刃. “紅頰”草莓組培標(biāo)準(zhǔn)化與生物反應(yīng)器擴(kuò)繁及穴盤壯苗技術(shù)研究[D]. 杭州：浙江理工大學(xué)，2013.

[6]楊 帆，張萬(wàn)博，朗賢波，等. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)樹(shù)莓組培苗增殖生長(zhǎng)的影響[J]. 延邊農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（1）：13-15.

[7]王海新，趙 艷，尤淑麗，等. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑“易豐收”對(duì)樹(shù)莓組培苗生根的影響[J]. 北方園藝，2013（4）：31-33.

[8]李 錢，田明芳. 樹(shù)莓組培快繁技術(shù)研究[J]. 北方果樹(shù)，2013（5）：11-12.

[9]陳 琦，陳 瑜，黃慶文，等. 樹(shù)莓莖尖組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（9）：1892-1898.

[10]郭玉霞，董彥琪，劉喜存，等. 紅樹(shù)莓組培快繁技術(shù)研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（4）：127-128.

[11]宋曉燕，郁松林，何 娟，等. GA3和6-BA混合處理對(duì)葡萄果穗致畸的發(fā)育解剖學(xué)研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（12）：2492-2501.

[12]陳君琛，賴譜富，周學(xué)劃，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化大球蓋菇粗多糖提取工藝[J]. 食品科學(xué)，2012，33（2）：139-142.

[13]Lentini Z，Mussell H，Mutschler M A，et al. Ethylene generation and reversal of ethylene effects during development in vitro of rapid-cycling Brassica campestris L.[J]. Plant Science，1988，54（1）：75-81.

[14]Monette P L. Micropropagation of kiwifruit using non-axenic shoot tips[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1986，6（1）：73-82.

[15]Mackay W A，Kitto S L. Factors affecting in vitro shoot proliferation of French tarragon[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，1988，113（2）：282-287.

[16]Tsuro M，Koda M，Inoue M. Efficient plant regeneration from multiple shoots formed in the leaf-derived callus of Lavandula vera using “theopen culture system”[J]. Scientia Horticulturae，2000，86 （1）：81-88.

[17]申 萍，王 政，何松林. 不同封口方式對(duì)牡丹試管苗生長(zhǎng)的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（2）：100-104.

[18]趙 強(qiáng)，余四九，王廷璞，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化禿瘡花中生物堿提取工藝及抑菌活性研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（4）：206-214.

[19]劉倩倩. 響應(yīng)面優(yōu)化鮮甘薯生料濃醪發(fā)酵乙醇工藝[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：302-304.

[20]楊 洋，胡永紅，楊文革，等. 多抗菌素發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：154-158.

[21]李春慧，蒲萬(wàn)霞，吳 潤(rùn)，等. 響應(yīng)面法對(duì)啤酒酵母菌制劑培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2014，44（10）：1095-1100.

[22]吳祥庭，朱 濤，鄭巧敏，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化山藥皮中皂苷提取的研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（6）：91-96.喬偉艷，顧洪如，沈益新. 稻茬種植多花黑麥草對(duì)水稻土土壤肥力的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：60-63.endprint