趙銀麗 王金榮 蘇蘭利

（河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

核酸適配體比色法檢測恩諾沙星

趙銀麗 王金榮 蘇蘭利

（河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

（目的）研究檢測恩諾沙星的膠體金核酸適配體比色法，（方法）將恩諾沙星核酸適配體與膠體金結(jié)合后形成膠體金適配體復合物，然后加入恩諾沙星靶標分子，由于核酸適配體與靶標的高效特異性結(jié)合，核酸適配體與膠體金解離。最后加入NaCl后，膠體金由紅變蘭。（結(jié)果）膠體金比色檢測體系中，NaCl的最佳濃度為1M，核酸適配體的最佳濃度為2μM。對恩諾沙星的比色檢測限為 15ng/mL。（結(jié)論）基于膠體金和核酸適配體的比色法可用于恩諾沙星的快速篩選。

恩諾沙星；膠體金；核酸適配體；檢測

恩諾沙星是動物專用的氟喹諾酮類藥物，主要用于治療畜禽細菌性疾病和支原體感染。但恩諾沙星的廣泛應(yīng)用造成了藥物在動物體內(nèi)的殘留，如果人類長期食用含低殘留的恩諾沙星食品，會對人類健康造成一定的危害。因此，通過有效的技術(shù)手段對動物組織中有關(guān)藥物殘留量進行檢測是非常必要的。本研究利用恩諾沙星的核酸適配體，建立了基于膠體金和核酸適配體的檢測恩諾沙星的比色法。

1 材料和方法

1.1 材料

恩諾沙星，環(huán)丙沙星，諾氟沙星，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；氯金酸（HAuCl4），檸檬酸三鈉，氯化鈉，由中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司提供。恩諾沙星的核酸適配體序列5’- CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA -3由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 檸檬酸鈉還原法制備膠體金

將氯金酸配制成1%的母液，低溫避光保存?zhèn)溆?。?%的氯金酸母液配制100ml 0.01%的氯金酸水溶液，用電爐加熱至沸騰狀態(tài)時，攪拌下均勻加入2.5 ml 1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸15min，然后室溫冷卻，得膠體金。

1.2.2 NaCL工作濃度的選擇

向100μl膠體金溶液中加入20μl不同濃度的NaCl溶液（0 M、0.5M、1M、2M），然后加入100μl雙蒸水，使體系總體積為220μl。觀察膠體金顏色的變化，以凝聚膠體金變蘭的濃度作為工作鹽濃度。

1.2.3 核酸適配體ssDNA工作濃度的選擇

向?qū)φ展苤屑尤?00μl膠體金和50μl滅菌雙蒸水；向?qū)嶒灩苤屑尤?100μl膠體金和50μl 不同濃度的ssDNA（0、1、2、4μM）。室溫下孵育10min，然后各加入20μl NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，根據(jù)其對膠體金的保護效果確定ssDNA的工作濃度。

1.2.4 核酸適配體比色法檢測恩諾沙星

首先向每個反應(yīng)管中加入100μl 膠體金和 50μl ssDNA，室溫孵育10min，然后向?qū)φ展苤屑尤?0μl 滅菌的雙蒸水，向?qū)嶒灩苤屑尤氩煌瑵舛鹊亩髦Z沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續(xù)孵育10min，然后向所有管中各加入20μl NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化。

1.2.5 核酸適配體比色法對恩諾沙星檢測的特異性

首先向每個反應(yīng)管中加入100μl 膠體金和 50μl ssDNA，室溫孵育10min，然后向?qū)φ展苤屑尤?0μl 滅菌的雙蒸水，向?qū)嶒灩苤屑尤氩煌瑵舛鹊亩髦Z沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續(xù)孵育10min，然后向所有管中各加入20μl NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，確定其檢測的特異性。

2 結(jié)果

2.1 NaCl工作濃度的選擇

向膠體金中加入不同濃度的NaCl鹽溶液（0 M、0.5M、1M、2M），觀察膠體金顏色的變化。結(jié)果見圖1.從結(jié)果來分析，膠體金溶液隨著NaCl添加濃度的增加，呈現(xiàn)從紅到紫、再到藍色的變化。與對照管膠體金相比，0.5M 的NaCl溶液使膠體金變紫，1M的NaCl溶液使膠體金變蘭。所以，1M 的NaCl溶液作為下一步實驗的選擇濃度。

圖1 凝聚膠體金溶液變蘭的鹽工作濃度選擇

2.2 核酸適配體ssDNA工作濃度的選擇

向?qū)φ展苤屑尤肽z體金和滅菌水，向?qū)嶒灩苤屑尤肽z體金和不同濃度的ssDNA（0、1、2、4μM）。孵育后各加入NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化。從結(jié)果分析，添加2μM ssDNA實驗管中的膠體金溶液顏色沒有變蘭，說明可以保護膠體金。所以確定2μM ssDNA 為工作濃度。結(jié)果見圖2.

圖2 核酸適配體ssDNA工作濃度的選擇

2.3 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的靈敏性

每個反應(yīng)管中加入 膠體金和 ssDNA，室溫孵育10min，然后向?qū)φ展苤屑尤霚缇驅(qū)嶒灩苤屑尤氩煌瑵舛鹊亩髦Z沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續(xù)孵育10min，然后向所有管中各加入 NaCL（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，結(jié)果見圖3.同對照管相比，添加不同濃度的恩諾沙星的實驗組，發(fā)生了顏色變化。并且隨著濃度的增加顏色從紅色向紫色、藍色變化。通過肉眼觀察，15ng/ml 實驗管顏色明顯變蘭，可作為肉眼比色的檢測限。

圖3 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的靈敏性

2.4 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的特異性

每個反應(yīng)管中加入 膠體金和 ssDNA，室溫孵育10min，然后向?qū)φ展苤屑尤霚缇?，向?qū)嶒灩苤屑尤氩煌瑵舛鹊亩髦Z沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續(xù)孵育10min，然后向所有管中各加入 NaCL（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，結(jié)果見圖4。

同對照管相比，添加不同濃度的恩諾沙星的實驗組，發(fā)生了顏色變化。并且隨著濃度的增加顏色從紅色向紫色、藍色變化。通過肉眼觀察，15ng/ml 實驗管顏色明顯變蘭，可作為肉眼比色的檢測限。而添加環(huán)丙沙星和諾氟沙星的實驗組（0，1，5，10，15，30 ng/ml），沒有發(fā)生顏色的變化。說明，在 1～30 ng/ml 濃度范圍下，此檢測方法只對恩諾沙星敏感。也說明了對恩諾沙星檢測的特異性。

圖4 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的特異性

3 討論

目前，對于恩諾沙星的檢測主要有色譜法和免疫學方法。色譜法需要昂貴的儀器和專門的人員，樣品前處理也較煩瑣，在基層大規(guī)模篩選中應(yīng)用受到一定的限制，常作為確證方法使用。而以抗體為核心試劑建立的免疫學方法，簡便、快速，常作為篩選方法使用。適配體作為一種單鏈DNA 分子，可以吸附在納米金表面，保護納米金免于高鹽引起的納米金團聚。當加入對應(yīng)的靶標時，適配體與靶標結(jié)合，從納米金上解離，失去保護的納米金在高鹽濃度下發(fā)生團聚，溶液顏色由紅變?yōu)樽仙蛩{色，而且顏色的變化與加入靶標的濃度成正比，可用于很多種物質(zhì)的檢測。納米金比色法具有結(jié)果肉眼可見、無需復雜儀器測量。納米金比色法在毒素、四環(huán)素、磺胺藥的檢測中得到了應(yīng)用。本研究中，基于膠體金和適配體的比色法可以實現(xiàn)對恩諾沙星的檢測。

[1] 陳雪嵐，金晶，楊曉慧.恩諾沙星快速酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒的研制[J].食品科學，2010，31（8）：16-19.

[2] 倪姮佳.恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶核酸適配體的篩選及化學發(fā)光檢測方法的研究[D].中國農(nóng)業(yè)大學，2014.

[3] 陳海榮，呂世明，譚艾娟，等.HPLC紫外法同時檢測生鮮乳中環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：1724-1725.

[4] 余法建，水柏年，龔云飛.水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留膠體金免疫層析技術(shù)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（7）：2059-2061.

[5] 劉金釧，呂珍珍，陳愛亮，等.適配體納米金比色分析技術(shù)研究進展[J].光譜學與光譜分析，2014，34（8）：2040-2046.

[6] 欒云霞，陳佳祎，陸安祥，等.基于非標記核酸適配體可視化檢測黃曲霉毒素B1的方法研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2014，5（3）：736-741.

河南省科技攻關(guān)項目（152102210263）

趙銀麗（1973—），女，山東莘縣人，副教授，博士，主要從事獸藥殘留檢測研究。