濮燕屏　王霞　馮鑫　邵菁　吳大強(qiáng)　汪天明　汪長(zhǎng)中

[摘要]該研究探討龍膽瀉肝湯氯仿提取物（CELX）對(duì)白念珠菌VVC臨床株外分泌水解酶的影響。分別采用牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80）培養(yǎng)基對(duì)15株白念珠菌VVC臨床株進(jìn)行分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）、磷脂酶（PL）、脂肪酶（Lip）陽性菌株的篩選；牛奶平板法、蛋黃平板法、吐溫80平板法分別檢測(cè)CELX干預(yù)后， Sap，PL與Lip的活性變化；qRTPCR 檢測(cè)基因SAP1～7，10，PLB1～2，LIP3～6的表達(dá)量。結(jié)果可見，15株VVC臨床株的Sap，PL均為陽性，11株Lip陽性菌株。隨著CELX劑量的遞增，與空白對(duì)照組相比，各含藥培養(yǎng)基（牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、吐溫80培養(yǎng)基）上菌落的沉淀圈逐漸減小，當(dāng)藥物達(dá)256 mg·L-1時(shí)，菌落沉淀圈幾乎消失，酶活力顯著減弱。qRTPCR 結(jié)果顯示，256 mg·L-1CELX時(shí)，除SAP5，SAP6外，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP7，SAP9，SAP10分別下調(diào)了62%，55%，62%，84%，61%，51%，68%；PLB1下調(diào)了67%；LIP3，LIP4，LIP6分別下調(diào)了51%，54%，55%。研究表明，CELX能抑制白念珠菌重要毒力因子天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶與脂肪酶的活性。

[關(guān)鍵詞]龍膽瀉肝湯氯仿提取物； 白念珠菌VVC臨床株； 分泌型天冬氨酸蛋白酶； 磷脂酶； 脂肪酶

[Abstract]To investigate the inhibitory effect and mechanism of chloroform extracts from Longdan Xiegan decoction（CELX） against hydrolytic enzymes activity of Candida albicans isolated from vulvovaginal candidiasis（VVC） patients Secreted aspartyl proteinase（Sap）， phospholipase（PL） and lipase（Lip） positive strains were identified from 15 strains of C albicans with milk culture medium， egg yolk culture medium and tween80 medium， respectively Then， the activities of Sap， PL， and Lip were detected in the above media qRTPCR was used to detect the changes in gene expressions of aspartic protease（SAP17，10）， phospholipase B（PLB12） and lipase（LIP36） Secreted aspartyl proteinase and phospholipase of 15 VVC clinical strains were positive， and lipase of 11 strains were positive Compared with the blank control group， the drug CELXcontaining medium（milk medium， egg yolk culture medium， tween80 medium） experiment showed that the sedimentation of colonies decreased gradually in each culture medium with the increase of CELX dose When the concentration of CELX was 256 mg·L-1， the colony almost disappeared， which indicated the enzyme activity was significantly weakened The results of qRTPCR showed that SAP1， SAP2， SAP3， SAP4， SAP7， SAP9 and SAP10 were downregulated by 62%， 55%， 62%， 84%， 61%， 51%， 68%， respectively， except for SAP5 and SAP6； and PLB1， LIP3， LIP4， LIP6 were downregulated by 67%， 51%， 54%， 55%， respectively The findings suggested that CELX may inhibit the activities of Sap， PL， and Lip， which are important virulence factors of C albicans.

[Key words]chloroform extracts from Longdan Xiegan decoction（CELX）； Candida albicans isolated from vulvovaginal candidasis patients； secreted aspartyl proteinase（Sap）； phospholipase（PL）； lipase（Lip）

白念珠菌（Candida albicans，Ca）是一種常見的條件致病性真菌，在菌群失調(diào)或免疫力下降時(shí)可引起外陰陰道念珠菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）、鵝口瘡等黏膜感染，甚至系統(tǒng)性感染。白念珠菌的致病性與其多種毒力因子密切相關(guān)，其中分泌型天冬氨酸酶（secreted aspartyl proteinase，Sap）、磷脂酶（phospholipase，PL）、脂肪酶（lipase，Lip）等水解酶通過介導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換、黏附、免疫逃逸等環(huán)節(jié)在菌體入侵宿主過程中發(fā)揮重要作用[1]。中藥復(fù)方龍膽瀉肝湯在臨床上常用于外陰陰道念珠菌?。╒VC）的治療[24]，但作用機(jī)制不詳。課題組近期研究證實(shí)，該復(fù)方的氯仿提取物對(duì)白念珠菌具有明顯的抑菌活性[5]，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討龍膽瀉肝湯氯仿提取物對(duì)白念珠菌VVC臨床株的毒力因子Sap，PL，Lip等水解酶的作用，為其治療VVC 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。endprint

1材料

11菌株15株白念珠菌VVC臨床株由合肥市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科陶瑞雪主任惠贈(zèng)，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基確定為白念珠菌，純化后保存在沙氏固體培養(yǎng)基上。

12藥物與儀器龍膽瀉肝湯氯仿提取物（CELX）的制備按參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[5]。ABI7000熒光定量PCR儀（美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司）。

13培養(yǎng)基的配制牛奶培養(yǎng)基：稱取葡萄糖20 g，酵母粉2 g，KH2PO4 5 g，瓊脂15 g加入蒸餾水1 000 mL，高壓滅菌后冷卻至45 ℃，加入10 g無菌脫脂奶粉，充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿，4 ℃保存，備用。

蛋黃培養(yǎng)基：稱取葡萄糖30 g，蛋白胨10 g，NaCl 575 g，CaCl2 055 g，瓊脂15 g加入蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH至55～60，高壓滅菌，冷卻至45 ℃左右加入無菌蛋黃80 mL，充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿，4 ℃保存，備用。

酯酶培養(yǎng)基：稱取蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl2 055 g，瓊脂15 g加入蒸餾水1 000 mL，高壓滅菌后冷卻至45 ℃，加入

5 mL聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80），充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿，4 ℃保存，備用。

2方法

21分泌型天冬氨酸酶（Sap）陽性菌株的篩選[6]微量移液器分別吸取15株VVC臨床株的菌懸液5 μL滴加于已配好的牛奶培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)5 d。觀察菌落周圍有無沉淀圈，拍照，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量培養(yǎng)基上各菌落直徑和沉淀圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

22磷脂酶（PL）陽性菌株的篩選[6]分別吸取15株VVC臨床株的菌懸液5 μL滴加于蛋黃培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。觀察菌落周圍有無沉淀圈，有沉淀圈者為陽性菌株，測(cè)量培養(yǎng)基上各菌落直徑和沉淀圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

23脂肪酶（Lip）陽性菌株的篩選[6]分別吸取15株VVC臨床株的菌懸液5 μL滴加于吐溫80培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)5 d。測(cè)量培養(yǎng)基上各菌落直徑和沉淀圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

24結(jié)果判定[6]Pz為菌落直徑與總直徑（菌落直徑+菌落周圍沉淀圈直徑）的比值[5]，各類水解酶的活性大小可采用Pz來表示：Pz為1表示無酶活力，090～099表示弱酶活力，080～089表示中度酶活力，070～079表示強(qiáng)酶活力，069以下表示極強(qiáng)酶活力。菌株的Pz為3次實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的平均值。通過比較各類水解酶的活性大小，從15株VVC臨床株篩選出分泌型天冬氨酸酶、磷脂酶、脂肪酶活性均較強(qiáng)的臨床株（CA09）進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

25平板法檢測(cè)陽性菌株CA09的3種水解酶活性[6]分別在配制牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、吐溫80培養(yǎng)基的過程中加入不同劑量的CELX藥液，使得各培養(yǎng)基中CELX的終濃度分別為64，128，256 mg·L-1。微量移液器吸取CA09臨床株的菌懸液5 μL分別滴加于含藥的牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、吐溫80培養(yǎng)基表面，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)5 d。測(cè)量各培養(yǎng)基上的菌落直徑和沉淀圈直徑，計(jì)算Pz，結(jié)果判定同24項(xiàng)。

26qRTPCR法檢測(cè)陽性菌株CA09的3種水解酶相關(guān)基因表達(dá)水平根據(jù)NCBI基因庫查得所需基因序列，并用Primer Premier 50 軟件設(shè)計(jì)所需引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物，各引物序列見表1。遵照TIANGEN公司FastQuant RT試劑盒（含gDNase）說明書的反應(yīng)條件將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

3結(jié)果

31分泌型天冬氨酸酶（Sap）陽性菌株的篩選15株白念珠菌VVC臨床株Sap均為陽性，且Pz均小于069，顯示酶活性均極強(qiáng)。見圖1與表2。

32磷脂酶（PL）陽性菌株的篩選15株白念珠菌VVC臨床株P(guān)L均為陽性，酶活性強(qiáng)度不一，其中有

A，B培養(yǎng)皿中均為Sap活性極強(qiáng)的陽性菌株。

3株為強(qiáng)酶活力，12株為極強(qiáng)酶活力。見圖2與表2。

A，B培養(yǎng)皿中不同PL活性的陽性菌株。

33脂肪酶（Lip）陽性菌株的篩選15株白念珠菌VVC臨床株Lip活性強(qiáng)度不均一，其中有4株Lip陰性，3株呈強(qiáng)酶活力，8株呈極強(qiáng)酶活力，見圖3與表2。

A，B，C培養(yǎng)皿中不同Lip活性的菌株。

34CELX對(duì)陽性菌株CA09的Sap活力的影響在CELX干預(yù)下，隨著用藥濃度的遞增，白念珠菌VVC臨床株CA09的SAP酶分解牛奶培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的能力逐漸受到抑制，培養(yǎng)基中形成的沉淀圈逐漸減小，當(dāng)CELX為256 mg·L-1時(shí)，幾乎無法觀察到菌株形成的沉淀圈，見圖4。

35CELX對(duì)陽性菌株CA09的PL活力的影響與空白對(duì)照組相比，隨著CELX劑量的增加，蛋黃培養(yǎng)基中菌落的沉淀圈逐漸減小，64 mg·L-1和128 mg·L-1CELX的沉淀圈變化不明顯，256 mg·L-1CELX的沉淀圈顯著減小，幾乎消失，見圖5。

A空白對(duì)照組；B 64 mg·L -1CELX；C128 mg·L -1CELX；D256 mg·L -1CELX（圖5，6同）。

36CELX對(duì)陽性菌株CA09的Lip活力的影響與空白對(duì)照組相比，隨著CELX劑量的遞增，吐溫80培養(yǎng)基中菌落的沉淀圈逐漸減。CELX為64 mg·L-1時(shí)，沉淀圈變化不明顯；128 mg·L-1時(shí)，沉淀圈較空白組顯著減??；

256 mg·L-1時(shí)，菌落沉淀圈幾乎消失，見圖6。

37CELX對(duì)陽性菌株CA09的SAP基因表達(dá)水平的影響與空白對(duì)照組相比，SAP基因均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。CELX在128 mg·L-1時(shí)，SAP1，SAP3，SAP4，SAP7分別下調(diào)了55%，59%，69%，57%；256 mg·L-1時(shí)，除SAP5，SAP6外，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP7，SAP9，SAP10分別下調(diào)了62%，55%，62%，84%，61%，51%，68%，見圖7。endprint

38CELX對(duì)陽性菌株CA09的PLB基因表達(dá)水平的影響與空白對(duì)照組相比，基因 PLB1，PLB2均有所下調(diào)。CELX在128 mg·L-1時(shí)，PLB1下調(diào)了55%；256 mg·L-1時(shí)PLB1下調(diào)了67%，見圖8。

39CELX對(duì)陽性菌株CA09的LIP基因表達(dá)水平的影響與空白對(duì)照組相比，基因LIP5在不同濃度的CELX干預(yù)下均有所下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。128 mg·L-1CELX干預(yù)后，僅有LIP4下調(diào)了53%；CELX為256 mg·L-1時(shí)，LIP3，LIP4，LIP6分別下調(diào)了51%，54%，55%，見圖9。

4討論

龍膽瀉肝湯出自《醫(yī)方集解》，方中龍膽草大苦

大寒，瀉火除濕；黃芩、梔子亦苦寒，瀉肝膽濕熱；木通、澤瀉、車前子清利肝經(jīng)濕熱；生地黃、當(dāng)歸養(yǎng)血滋陰；柴胡疏暢肝膽之氣，引諸藥入肝膽經(jīng)；甘草調(diào)和諸藥。方中諸藥合用，共奏瀉肝膽實(shí)火，清下焦?jié)駸?。中醫(yī)認(rèn)為，外陰陰道念珠菌?。╒VC）的“帶下”、“陰癢”等表現(xiàn)多屬肝經(jīng)濕熱內(nèi)蘊(yùn)，屬龍膽瀉肝湯主治范圍[7]。故龍膽瀉肝湯為歷代醫(yī)家治療外陰陰道念珠菌病時(shí)所廣為采用，但龍膽瀉肝湯治療VVC的作用機(jī)制尚不明確。

研究表明，VVC的致病機(jī)制與白念珠菌的侵襲力密切相關(guān)[89]。除菌絲及侵襲素（如ssa1，als3）外，分泌型天冬氨酶（Sap）、磷脂酶（PL）和脂肪酶（Lip）等水解酶是促進(jìn)白念珠菌侵襲宿主的重要毒力因子。其中天冬氨酸酶（Sap）的有關(guān)研究最為多見，Sap家族由10個(gè)基因（SAP1～SAP10）編碼，具有較強(qiáng)的蛋白水解活性，能水解多種宿主蛋白，如角蛋白、膠原蛋白和波形蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以及細(xì)胞間黏連蛋白等，從而破壞宿主的防御機(jī)制，有助于白念珠菌對(duì)宿主組織的侵襲[1011]。Pericolini E等[12]發(fā)現(xiàn)，將Sap注射進(jìn)小鼠陰道內(nèi)，引起的炎癥反應(yīng)與菌體感染效果一樣，且使用抗Sap抗體與蛋白酶抑制劑Pepstatin A治療，能明顯抑制Sap所引起的炎癥反應(yīng)，證明Sap在VVC中的重要性。除Sap外，磷脂酶（PL）通過影響宿主細(xì)胞脂類代謝而發(fā)揮重要作用，根據(jù)水解磷脂鍵的不同，PL可分為PLA，PLB，PLC，PLD 4型，其中PLB水解細(xì)胞膜中的磷脂，從而引起宿主細(xì)胞膜的通透性增高，白念珠菌透過受損的細(xì)胞膜侵入宿主細(xì)胞[1314]。此外，脂肪酶（Lip）催化甘油三酯的水解和合成，是白念珠菌另一個(gè)重要的毒力因子[1516]。

鑒于現(xiàn)有的抗真菌藥物均以真菌的結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等）為靶標(biāo)而未見有以毒力因子外分泌酶為靶標(biāo)的抗菌機(jī)制，故本實(shí)驗(yàn)未采取陽性藥對(duì)照。實(shí)驗(yàn)通過特異性培養(yǎng)基篩選出同時(shí)滿足Sap，PL，Lip活力均很強(qiáng)的陽性菌株CA09。其中Sap的活性檢測(cè)采用牛奶培養(yǎng)基法，以脫脂奶粉作為唯一氮源，白念珠菌分泌的Sap對(duì)其水解的效果可直接通過培養(yǎng)基中的沉淀圈觀測(cè)。白念珠菌分泌的PL可以將培養(yǎng)基中的蛋黃分解為脂肪酸，培養(yǎng)基中添加的鈣成分能與之結(jié)合，在菌落周圍形成肉眼可見的白色沉淀圈，沉淀圈的大小與酶的活力成正相關(guān)。

龍膽瀉肝湯氯仿提取物（CELX）對(duì)所選菌株3類水解酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)CELX為256 mg·L-1時(shí)，Sap活力明顯減弱，PL，Lip活力也被顯著抑制，推測(cè)CELX能降低外分泌酶的活性而抑制白念珠菌對(duì)宿主組織的侵襲力。此外，還進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了CELX對(duì)Sap，PL，Lip相關(guān)基因表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)CELX為128 mg·L-1時(shí)，SAP1，SAP3，SAP4，SAP7基因出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，且均具有顯著性差異；當(dāng)CELX為256 mg·L-1時(shí)，SAP4下調(diào)最顯著，達(dá)到84%。在編碼PL的2個(gè)基因PLB1，PLB2中，CELX對(duì)PLB1的作用比對(duì)PLB2的作用更明顯。128 mg·L-1的CELX使PLB1下調(diào)了55%，256 mg·L-1時(shí)PLB1下調(diào)了67%。對(duì)于LIP，除基因LIP5下調(diào)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，LIP3，LIP4，LIP6在256 mg·L-1CELX作用下均呈現(xiàn)明顯下調(diào)，分別下調(diào)了51%，54%，55%。綜上，CELX對(duì)水解酶Sap，PL，Lip活力的抑制可能與其對(duì)該3種酶在基因水平上的下調(diào)相關(guān)。

目前，常規(guī)的抗真菌藥物作用的靶點(diǎn)均在菌體結(jié)構(gòu)性組成本身，如棘白菌素類作用于細(xì)胞壁，唑類或兩性霉素B作用于細(xì)胞膜，5氟胞嘧啶作用于核酸等。這些藥物長(zhǎng)期作用下，由于選擇壓力，菌株易產(chǎn)生耐藥性，且抗真菌藥物的毒副作用均較大。選擇對(duì)菌體本身影響不大而以其產(chǎn)生的毒力因子（如本文中白念珠菌的3種外分泌酶Sap，PL，Lip）為靶標(biāo)的藥物已成為近年來抗菌藥物研發(fā)的新策略，因不直接針對(duì)病原體，故一般不會(huì)引起耐藥突變株的產(chǎn)生，也不會(huì)導(dǎo)致菌群失調(diào)[1718]。由于本研究中的供試藥為中藥復(fù)方，其作用的有效成分或詳細(xì)作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint