黃桂東，彭家偉，鐘先鋒*，上官國(guó)蓮，郭穎媚，黃雯麗，梁清翠

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528000）

半干型紹興黃酒中主要高級(jí)醇含量檢測(cè)及其香氣貢獻(xiàn)分析

黃桂東，彭家偉，鐘先鋒*，上官國(guó)蓮，郭穎媚，黃雯麗，梁清翠

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528000）

黃酒是我國(guó)特有的發(fā)酵酒。在種類繁多，風(fēng)格各異的黃酒中，半干型紹興黃酒是我國(guó)傳統(tǒng)黃酒的主要代表之一。其口感柔和、鮮爽，高級(jí)醇是其主要風(fēng)味物質(zhì)。該研究通過(guò)頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用的方法檢測(cè)了半干型紹興黃酒中關(guān)鍵高級(jí)醇的種類及含量，并對(duì)其風(fēng)味貢獻(xiàn)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，半干型紹興黃酒中主要的高級(jí)醇主要是異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇，其對(duì)黃酒風(fēng)味貢獻(xiàn)的順序?yàn)椋害?苯乙醇＞異戊醇＞異丁醇，樣品加標(biāo)回收率在97.05%～101.37%，相關(guān)系數(shù)R＞0.96，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.16%～5.91%。該結(jié)果對(duì)科學(xué)評(píng)價(jià)黃酒風(fēng)味有一定指導(dǎo)意義。

黃酒；高級(jí)醇；頂空固相微萃取；香氣活力值

黃酒是以糯米、小麥為主要原料，利用酒藥、麥曲或米曲所含的多種微生物的共同作用，釀制而成的發(fā)酵酒，是我國(guó)的民族特產(chǎn)[1]。根據(jù)含糖量的多少，黃酒分為干型黃酒（總糖含量≤15g/L）、半干型黃酒（總糖含量15～40g/L）、半甜型黃酒（總糖含量40～100 g/L）和甜型黃酒（總糖含量≥100 g/L）[2]。

釀造原料、所用糖化發(fā)酵劑、工藝操作方法等的不同，造就了黃酒品種繁多，風(fēng)格各異等特點(diǎn)[3]。其中紹興黃酒是中國(guó)傳統(tǒng)黃酒的代表[4]。1999年，紹興黃酒成為國(guó)家首批原產(chǎn)地域保護(hù)產(chǎn)品[5]。2006年，紹興黃酒釀制技藝被列入首批國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。由于口感柔和、鮮爽的特點(diǎn)，半干型黃酒（主要是加飯酒）成為目前紹興地區(qū)廣泛生產(chǎn)及銷售的黃酒品種[6]。但飲酒消費(fèi)者認(rèn)為，與其他酒種相比，飲用黃酒更易導(dǎo)致“上頭”、“深醉”，飲后舒適度較差[7]。對(duì)伏特加（無(wú)高級(jí)醇）和威士忌與人宿醉關(guān)系的研究結(jié)果表明，高級(jí)醇是導(dǎo)致“宿醉”的關(guān)鍵因素[8]。

高級(jí)醇（higher alcohols）俗稱“雜醇油”（fusel oil），是指含3個(gè)以上碳原子醇類的總稱，是釀酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，也是酒類主要風(fēng)味物質(zhì)之一[9]。高級(jí)醇的種類、含量與黃酒的口感、品質(zhì)有很大的關(guān)系[10]。黃酒中的高級(jí)醇主要有異丙醇、烯丙醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、叔丁醇、異戊醇、正戊醇、苯甲醇、β-苯乙醇等[11-12]。但是，哪些是影響半干型紹興黃酒品質(zhì)的主要高級(jí)醇，目前還未有明確結(jié)果。因此，本研究擬采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用（headspacesolid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）分析技術(shù)[13-14]，從客觀定量的角度檢測(cè)半干型紹興黃酒中關(guān)鍵高級(jí)醇的含量，結(jié)合高級(jí)醇的閾值，確定半干型紹興黃酒中主要高級(jí)醇的風(fēng)味貢獻(xiàn)，為高品質(zhì)黃酒釀造提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇了具代表性的不同酒齡、不同品種的半干型紹興黃酒樣品12種，各指標(biāo)如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品及相應(yīng)的指標(biāo)Table 1 Sample wine and corresponding indexes

2-辛醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正己醇、β-苯乙醇、正庚醇等（純度均為99%）：美國(guó)Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoFisherTrace氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo公司；50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制體積分?jǐn)?shù)為15%的乙醇溶液。配制高級(jí)醇母液（5 mg/mL），用體積分?jǐn)?shù)15%乙醇作溶劑，分別稱取0.05 g異戊醇、異丁醇、β-苯乙醇、正丁醇、正己醇、正庚醇溶于10 mL體積分?jǐn)?shù)15%乙醇溶液中。

配制不同濃度的標(biāo)樣溶液：用體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇溶液將母液分別稀釋5倍、10倍、20倍、40倍、100倍，配制成標(biāo)樣。

1.3.2 色譜條件

HS-SPME條件：取0.5 mL黃酒發(fā)酵液，加入20 mL頂空瓶中，加5.44 mL體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇和60 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，質(zhì)量濃度為8 800 μg/L），使用50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，50℃萃取吸附40 min，250℃解吸7 min，用于GC-MS分析。

GC條件：TG-WAXMS色譜柱（30m×0.25μm×0.25mm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），不分流，流速為1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：起始溫度40℃，保持3min，以6℃/min的速率升溫至100℃，然后以10℃/min升溫至230℃，保持7 min。

MS條件：離子化方式為電子電離（electronicionization，EI）源；發(fā)射電流50 μA；電子能量70eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；掃描質(zhì)量范圍33～400 amu。

1.3.3 色譜分析儀進(jìn)樣分析

分別取標(biāo)樣500μL，各自加入60μL2-辛醇（8800μg/L）和5.44 mL體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇溶液，使用50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，50℃萃取吸附40 min，250℃解吸7 min，用于GC-MS分析，得出氣相色譜圖，確定出各個(gè)高級(jí)醇的保留時(shí)間。

1.3.4 方法重現(xiàn)性的測(cè)定

對(duì)標(biāo)樣溶液平行進(jìn)樣5次，測(cè)定結(jié)果及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 酒樣中高級(jí)醇含量的計(jì)算方法

采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定高級(jí)醇含量，選擇的內(nèi)標(biāo)是2-辛醇。經(jīng)過(guò)GC-MS檢測(cè)后利用高級(jí)醇和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)峰面積代入方程（1），計(jì)算出酒中高級(jí)醇的含量。具體計(jì)算方法如下：

式中：C為黃酒液中高級(jí)醇的含量，μg/L；Cis為內(nèi)標(biāo)物的含量，μg/L；Ac為黃酒液中高級(jí)醇的峰面積；Ais為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.3.6 香氣活力值計(jì)算方法

香氣活力值（odor activity value，OAV）的計(jì)算公式為U=F/T，其中U代表香氣成分的香氣強(qiáng)度（即香氣活力值），F(xiàn)代表香氣成分的質(zhì)量濃度，μg/L；T代表香氣成分的閾值，μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 半干型紹興黃酒中的主要高級(jí)醇-定性分析

采用HS-SPME/GC-MS的方法分別對(duì)表1中涉及的市售半干型紹興黃酒進(jìn)行了分析測(cè)定，3年酒齡的樣品1黃酒中的高級(jí)醇色譜圖見(jiàn)圖1（其他樣品高級(jí)醇種類色譜圖與之相似未列出）。

圖1 3年酒齡的黃酒中高級(jí)醇色譜圖Fig.1 Chromatogram of higher alcohols in three year aged rice wine

由圖1可知，異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇是半干型紹興黃酒中的主要高級(jí)醇種類。該結(jié)果與CHEN S等[2]的研究結(jié)果相似，其認(rèn)為異戊醇和β-苯乙醇是黃酒主要的高級(jí)醇，約占黃酒高級(jí)醇總量的80%以上[15]。

2.2 主要高級(jí)醇的定量檢測(cè)

2.2.1 主要高級(jí)醇的回歸方程、線性范圍

將標(biāo)樣溶液按照不同濃度梯度依次進(jìn)樣，通過(guò)氣相色譜儀測(cè)得各自的峰面積，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品平行進(jìn)樣3次，根據(jù)各個(gè)組分的峰面積同濃度的比值求線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，所得的回歸曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.96。

表2 主要高級(jí)醇的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equation and linearity range of major higher alcohols

2.2.2 方法精密度和回收率的測(cè)定

選取某一種標(biāo)樣為樣品，按照高級(jí)醇定量測(cè)定的方法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如表3所示。由表3可知，該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%～5.91%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果越集中，方法精密度越好。表3的RSD較小，說(shuō)明該方法精密度較高。

選取樣品1中陳化5年的黃酒樣品，加入一定量的高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。由表4可知，本法加標(biāo)回收率為97.05%～101.37%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較高。

表4 5年酒齡的黃酒的加標(biāo)回收率檢測(cè)結(jié)果Table 4 Determination results of recovery rate of the five year aged rice wine

2.2.3 酒樣的測(cè)定

按照上述確定的測(cè)定方法，對(duì)不同酒齡、來(lái)自不同廠家的市售半干型紹興黃酒進(jìn)行了氣相色譜分析，平行進(jìn)樣3次，測(cè)定酒樣中主要高級(jí)醇含量，結(jié)果如表5所示。

表5 市售半干型紹興黃酒中主要高級(jí)醇含量Table 5 Main higher alcohol contents in commercial Chinese rice wine from Shaoxing mg/L

由表5可知，半干型紹興黃酒中β-苯乙醇的含量最高，其次是異戊醇和異丁醇，3種高級(jí)醇的含量之和占總含量的87.77%～99.30%。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能與4類黃酒釀造工藝及麥曲添加量不同有關(guān)。由表5還可知，高級(jí)醇的含量與其貯存時(shí)間有一定的關(guān)系。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，高級(jí)醇含量有所降低。這可能與在貯存過(guò)程中高級(jí)醇被氧化相關(guān)。

2.3 主要高級(jí)醇對(duì)半干型紹興黃酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)分析

香氣強(qiáng)度可以用OAV來(lái)表示，以此描述各香氣物質(zhì)對(duì)黃酒香氣的貢獻(xiàn)程度。如果OAV＜1，說(shuō)明嗅覺(jué)器官對(duì)該香氣物質(zhì)無(wú)感覺(jué)或嗅不到該香氣物質(zhì)的氣味[16]。OAV越大，說(shuō)明該香氣物質(zhì)越有可能成為黃酒的特征香氣成分，通過(guò)OAV的大小排序確定黃酒中主要高級(jí)醇的貢獻(xiàn)大小。

表6 市售半干型紹興黃酒的香氣強(qiáng)度Table 6 Aroma intensity of major higher alcohols in commercial Chinese rice wine from Shaoxing

由表6可知，市售半干型紹興黃酒香氣強(qiáng)度排序?yàn)椋害?苯乙醇＞異戊醇＞異丁醇，從排序可以看出，不同年份的半干型紹興黃酒中，β-苯乙醇對(duì)香氣貢獻(xiàn)最大，其次是異戊醇，異丁醇對(duì)香氣貢獻(xiàn)最小。三種高級(jí)醇中，β-苯乙醇、異戊醇的OAV均＞1，且β-苯乙醇的OAV比異丁醇和異戊醇都大很多，說(shuō)明β-苯乙醇是半干型紹興黃酒的主要特征香氣物質(zhì)。異丁醇OAV＜1，一般認(rèn)為對(duì)黃酒樣品的整體氣味沒(méi)有貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同廠家、不同酒齡市售半干型紹興黃酒高級(jí)醇含量檢測(cè)及其香氣強(qiáng)度分析，發(fā)現(xiàn)半干型紹興黃酒中的高級(jí)醇主要異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇，其對(duì)黃酒風(fēng)味貢獻(xiàn)的順序?yàn)棣?苯乙醇＞異戊醇＞異丁醇。該結(jié)果為高品質(zhì)黃酒的生產(chǎn)提供了一定的理論參考。

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Main higher alcohol contents determination and aroma contribution analysis of semi-dry Shaoxing rice wine

HUANG Guidong,PENG Jiawei,ZHONG Xianfeng*,SHANGGUAN Guolian,GUO Yingmei,HUANG Wenli,LIANG Qingcui
(Foshan Engineering Research Center for Brewing Technology,Foshan University,Foshan 528000,China)

Chinese rice wine is a traditional fermented alcoholic drink in China.In great variety and different styles of Chinese rice wine,semi-dry Shaoxing rice wine is one of the major representative Chinese rice wine types.It has gentle flavor,fresh and clear taste,and higher alcohols are important flavor compounds.The key higher alcohol variety and contents of Shaoxing rice wine were determined by solid phase microextraction combined with GC-MS,and the aroma contribution was analyzed.Results showed that the main higher alcohols of semi-dry Chinese rice wine from Shaoxing was isobutyl alcohol,isoamyl alcohol,and β-phenylethyl alcohol,the aroma activity contribution to the rice wine was β-phenylethyl alcohol＞isoamyl alcohol＞isobutyl alcohol.The results of recovery test was 97.05%-101.37%,R＞0.96,RSD was 2.16%-5.91%.All these might be benefit to the flavor evaluation of Chinese rice wine.

Chinese rice wine;higher alcohols;headspace-solid phase microextraction;aroma activity value

TS261.2

0254-5071（2017）10-0159-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.033

2017-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31501476，31660459）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20150139）；佛山市科技局項(xiàng)目（2016AB000011，2015AG10011，2016GA10155）；無(wú)錫市衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)項(xiàng)目（YGZYZ1508）

黃桂東（1978-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸飸?yīng)用及發(fā)酵工程。

*通訊作者：鐘先鋒（1981-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全控制。