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        中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

        2017-11-17 09:41:13亓秀曄謝全喜于佳民曾佳佳徐海燕
        中國釀造 2017年10期
        關(guān)鍵詞:棉粕棉酚乳酸桿菌

        亓秀曄,謝全喜,陳 振,于佳民,曾佳佳,徐海燕,谷 巍

        (山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東 泰安 271000)

        中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

        亓秀曄,謝全喜,陳 振,于佳民,曾佳佳,徐海燕,谷 巍

        (山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東 泰安 271000)

        該實驗旨在利用芽孢桿菌(Bacillus)和乳酸桿菌(Lactobacillus)發(fā)酵棉粕,研究對棉粕中游離棉酚降解率及飼料活菌數(shù)的影響。研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌BLCC1-0039在37℃發(fā)酵24 h后棉酚降解率達到85.89%(P<0.05),產(chǎn)中性蛋白酶活性達到2 811.40 U/g發(fā)酵料(P<0.05);發(fā)酵48 h時棉酚降解率達到91.47%,產(chǎn)中性蛋白酶活性達到2303.24 U/g。單獨添加中性蛋白酶發(fā)酵24 h時,添加量為1 000 U/g的棉酚降解率已達到58.46%,2 000 U/g時棉酚降解率達到72.68%;發(fā)酵48 h時1 000 U/g的棉酚降解率已達到73.29%。乳酸菌發(fā)酵棉粕不能降解棉酚,但乳酸桿菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶發(fā)酵24 h時,棉酚降解率達到67.13%,pH值降至4.71。

        中性蛋白酶;棉酚;棉粕;芽孢桿菌;乳酸桿菌

        我國蛋白質(zhì)飼料資源嚴重短缺,而棉粕產(chǎn)量高且價格低廉,棉粕蛋白含量高達38%~50%,粗纖維約11%,此外B族維生素、硫胺素和有機磷也比較多[1-2],同大豆粕一樣是重要的蛋白質(zhì)飼料資源[3]。然而,棉籽餅中含有棉酚、環(huán)丙稀脂肪酸、單寧等抗營養(yǎng)因子物質(zhì),其中最主要的是棉酚,如果未經(jīng)脫毒長期飼喂畜禽,則很易引起中毒甚至死亡,嚴重降低飼用價值[4-5]。目前,降解棉酚的方法主要有化學法、物理法和微生物發(fā)酵法等,其中微生物發(fā)酵法可以將棉酚轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì),達到脫毒目的,既不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物,又可提高粗飼料的營養(yǎng)價值,增加適口性和采食量,是目前普遍認為的成本低、效果好、較安全的脫毒方法[6-8]。但不同微生物菌種對棉酚的降解能力有較大的差異,篩選優(yōu)良的微生物菌種是影響棉籽餅粕脫毒效果和營養(yǎng)價值的首要步驟。

        中性蛋白酶主要作用為在中性條件下水解蛋白質(zhì)的肽鍵,釋放氨基酸或者多肽,最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面[9],近年來更發(fā)展出許多新的用途[10-11]??莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[12],是當今工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌種之一,是工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的菌種之一,其產(chǎn)中性蛋白酶能力為芽孢菌生長的主要的考察指標[13]。據(jù)報道,枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕,特別是加入木瓜蛋白酶后可有效提高棉粕的營養(yǎng)價值[14]。目前報道的用于棉籽餅粕脫毒的芽孢菌的相關(guān)研究有枯草芽孢桿菌菌株M-9[15]和菌株M-4[16],這兩株菌對棉酚具有較高的降解活性。乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能性飼料,具有氣味香、適口性好、飼喂簡單方便、消化率高、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢,具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價值[17-18]。但是兩種菌單獨發(fā)酵時也存在一定不足,如枯草芽孢菌發(fā)酵過程中脫羧或脫氨作用會產(chǎn)生有機酸和氨氣,會有刺鼻的氨味,乳酸菌降解棉酚效果不顯著等。本研究旨在利用芽孢桿菌和乳酸桿菌對棉粕進行固態(tài)發(fā)酵,充分利用兩種菌的優(yōu)勢,達到降低棉酚含量,同時提高棉粕蛋白利用率,改善棉粕品質(zhì)的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 發(fā)酵原材料及菌株

        棉粕由新疆泰昆生物集團提供,粉碎過40目篩。

        芽孢桿菌(Bacillus)菌株:BLCC1-0039、BLCC1-0090、BLCC1-0157和BLCC1-0169;乳酸桿菌(Lactobacillus)菌株:BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111,均由山東寶來利來生物工程股份有限公司保存。中性蛋白酶(酶活性50 000 U/g):山東隆科特酶制劑有限公司。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基:葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%,pH值7.0,121℃滅菌20 min。

        MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,牛肉膏8g/L,酵母膏4 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,硫酸錳0.3 g/L,檸檬酸銨2 g/L,乙酸鈉5 g/L,吐溫-80 1 mL/L,pH值6.0,121℃滅菌20 min。

        1.1.3 化學試劑

        葡萄糖:山東祥瑞藥業(yè)有限公司;硫酸鎂、硫酸錳:濟南匯豐達化工有限公司;檸檬酸銨:上海撫生實業(yè)有限公司;乙酸鈉:青島捷世康生物科技有限公司;吐溫-80、氫氧化鈉、磷酸、氯化鈉:天津博迪化工股份有限公司;以上試劑均為分析純。乙腈、丙酮(色譜級)、甲醇(色譜級):天津市永大化學試劑有限公司;微孔濾膜(直徑13mm、孔徑0.45μm):上海安譜有限公司;棉酚標準品(純度98%):上海源葉生物科技有限公司。蛋白胨:北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;牛肉膏、酵母膏:天津市英博生化試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;THZ-C恒溫振蕩器:揚州培英實驗儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;LDE-2A低速離心機:北京時代北利離心機有限公司;SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;SB1200超聲波清洗機:寧波新芝生物科技股份有限公司;LC-20AT液相色譜儀:日本島津公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 種子液制備

        取經(jīng)過兩次活化的芽孢菌斜面一環(huán)于裝有100 mL酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,待用。取經(jīng)過兩次活化的乳酸菌斜面一環(huán)于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,37℃靜置培養(yǎng)24 h待用。

        1.3.2 芽孢桿菌的篩選

        生料發(fā)酵。稱取一定量的基料于1 000 mL三角瓶中,料水比為1∶0.4(g∶mL),裝量100 g/瓶,按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的芽孢菌種子液,每個樣品設(shè)3個平行,以不接種任何菌株的空白料為對照,均置于37℃培養(yǎng)箱進行需氧發(fā)酵,分別于發(fā)酵24h和48h取樣,測定發(fā)酵樣芽孢菌活菌數(shù)、中性蛋白酶活性及棉酚含量。優(yōu)選芽孢菌活菌數(shù)較高、產(chǎn)中性蛋白酶活性較高并能有效降解棉酚含量的菌株。

        1.3.3 乳酸桿菌的篩選

        生料發(fā)酵。稱取一定量的基料裝袋,料水比為1∶0.4(g∶mL),裝量100 g/袋,按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的乳酸菌種子液,密封。每個樣品設(shè)3個平行,以不接種任何菌株的空白料為對照,均置于37℃培養(yǎng)箱進行厭氧發(fā)酵,分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣,測定發(fā)酵樣乳酸菌活菌數(shù)、pH值及棉酚含量。優(yōu)選乳酸菌活菌數(shù)較高且pH值較低的菌株。

        1.3.4 棉粕中添加不同濃度中性蛋白酶發(fā)酵

        生料發(fā)酵。稱取一定量的基料裝袋,裝量100 g/袋,設(shè)置中性蛋白酶濃度梯度為0、1 000 U/g、2 000 U/g、4 000 U/g和8 000 U/g基料,按照料水比1∶0.4(g∶mL)先溶解中性蛋白酶,完全加入基料中,混勻,密封。每個樣品設(shè)3個平行,均置于37℃培養(yǎng)箱進行厭氧發(fā)酵,分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣,測定發(fā)酵樣棉酚含量。

        1.3.5 乳酸菌加中性蛋白酶發(fā)酵

        生料發(fā)酵。稱取一定量的基料裝袋,裝量100 g/袋,根據(jù)1.3.4種篩選的最優(yōu)中性蛋白酶添加量1 000 U/g基料,按照料水比1∶0.4(g∶mL)先溶解中性蛋白酶,完全加入基料中,混勻,密封。每個樣品設(shè)3個平行,均置于37℃培養(yǎng)箱進行厭氧發(fā)酵,分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣,測定發(fā)酵樣乳酸菌活菌數(shù)、pH值及棉酚含量。

        1.3.6 測定指標及方法

        (1)pH值的測定

        取10g樣品加入90mL滅菌后的生理鹽水中,攪拌均勻后直接測定。

        (2)芽孢桿菌和乳酸桿菌活菌數(shù)的測定

        準確稱取發(fā)酵棉粕10.0 g,用生理鹽水10倍遞增稀釋,取適當稀釋度的樣品分別至酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48 h,根據(jù)菌落數(shù)計算樣品中芽孢桿菌和乳酸桿菌活菌數(shù),結(jié)果用CFU/g發(fā)酵料表示。

        (3)中性蛋白酶活性的測定

        取發(fā)酵棉粕1.0 g,采用福林-酚試劑法測定樣品中中性蛋白酶活性。中性蛋白酶酶活定義:1g固體酶粉(或1mL液體酶),在一定溫度和pH值條件下,1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位,以U/g表示。

        (4)棉酚含量的測定[19]

        棉酚標準溶液的配制:準確稱取棉酚標準品用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶解得到1.21 mg/mL的標準品貯備液,貯備液再用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)稀釋成121 μg/mL的標準品工作液。用流動相將標準品工作液逐級稀釋得到質(zhì)量濃度分別為61.50 μg/mL、20.17 μg/mL、5.04 μg/mL、2.52 μg/mL和1.21 μg/mL的標準工作液,以峰面積(X)和質(zhì)量濃度(Y)作圖,得到標準曲線回歸方程為:Y=0.000 005 45X+0.160 525(R2≥0.999 96),線性范圍為1.21~121.00 μg/mL。

        待測樣品游離棉酚的提?。簻蚀_稱取待測樣品3.00 g,加入丙酮30 mL,超聲提取30 min,3 000 r/min 25℃離心10 min,重復(fù)提取3次,合并上清液。全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液溶解,多次超聲清洗轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶,定容,過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)測定。棉酚含量計算公式如下:

        式中:c為棉酚溶液的質(zhì)量濃度,μg/mL;m為樣品質(zhì)量,g。高效液相色譜(HPLC)法測定棉酚含量:色譜柱為Intertsil RODS-2(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液,流速1.0 mL/min,紫外檢測波長235 nm,進樣量20 μL,柱溫25℃。

        1.3.7 數(shù)據(jù)分析

        試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行初步處理后,采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析,采用ANOVA進行方差分析,最小顯著差異法(leastsignificantdifference,LSD)法進行組間多重比較,結(jié)果以“平均值±標準差”表示,P<0.05表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 芽孢桿菌的篩選

        不同芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響見表1。由表1可知,除菌株BLCC1-0040在發(fā)酵24 h和48 h時活菌數(shù)在108CFU/g水平外,其余菌株均在109CFU/g水平,48 h時菌株BLCC1-0039、BLCC1-0157和BLCC1-0169均達到1010CFU/g水平,且各取樣時間點的中性蛋白酶活性也均在1 000 U/g以上,以菌株BLCC1-0039最高,發(fā)酵24 h時,中性蛋白酶活性高達2 811 U/g,顯著高于其他組(P<0.05),棉酚含量最低,降解率達到85.89%,其次為菌株BLCC1-0157,中性蛋白酶活性為1 716 U/g,棉酚降解率為81.95%,均顯著高于其他三組菌株發(fā)酵(P<0.05)。發(fā)酵48 h時,菌株BLCC1-0039產(chǎn)中性蛋白酶活性達到2 303.24 U/g,棉酚降解率達91.47%,與其他菌株發(fā)酵差異顯著(P<0.05)。綜上所述,芽孢桿菌BLCC1-0039產(chǎn)中性蛋白酶活性高、降解棉酚能力強,最適宜發(fā)酵棉粕。

        表1 不同芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響Table 1 Effect ofBacillusspp.on fermented feed quality

        2.2 乳酸桿菌的篩選

        表2 不同乳酸桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響Table 2 Effect ofLactobacillusspp.on fermented feed quality

        不同乳酸桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響見表2。由表2可知,發(fā)酵24 h時除菌株BLCC2-0112活菌數(shù)在108CFU/g水平外,其余菌株均在109CFU/g水平,差異不顯著(P>0.05);pH值方面,發(fā)酵24 h時菌株BLCC2-0092和BLCC2-0001發(fā)酵的飼料pH值最低,分別為5.47和5.49,其次為菌株BLCC2-0015(5.77),48 h時三株菌發(fā)酵棉粕的pH均降至5.00以下,其中菌株BLCC2-0092發(fā)酵48 h時最低達到4.67;棉酚含量方面,各菌株間差異不顯著(P>0.05),與對照相比幾乎均沒有降解棉酚的能力。綜合發(fā)酵活菌數(shù)和降低pH值結(jié)果來看,乳酸桿菌BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015較適宜發(fā)酵棉粕,其次為菌株BLCC2-0111。

        2.3 中性蛋白酶對棉酚含量的影響

        由表3可知,添加中性蛋白酶發(fā)酵棉粕降低了棉酚含量,24 h時,中性蛋白酶添加量1 000 U/g時棉酚降解率已達到58.46%;2 000 U/g的添加量時棉酚降解率最高,達到72.68%;超過2 000 U/g時,棉酚降解率并沒有隨著中性蛋白酶添加量的升高而繼續(xù)升高。48 h時,1 000 U/g時棉酚降解率最高為73.29%。說明適量中性蛋白酶的添加可有效降解棉酚,1 000 U/g的中性蛋白酶添加量已達到較優(yōu)效果。

        表3 不同中性蛋白酶添加量發(fā)酵對棉粕中棉酚含量的影響Table 3 Effect of neutral protease addition on fermented feed quality

        2.4 乳酸桿菌加中性蛋白酶發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響

        乳酸桿菌加中性蛋白酶(1 000 U/g)發(fā)酵棉粕對棉酚含量的影響見表4。由表4可知,添加中性蛋白酶的乳酸桿菌發(fā)酵有效降解了棉粕中棉酚含量,菌株BLCC2-0092降解棉酚效果較好,24 h時棉酚降解率達到67.13%,其次為菌株BLCC2-0001,棉酚降解率為60.43%,均顯著高于菌株BLCC2-0015(P<0.05)和BLCC2-0111(P<0.05),后兩者的棉酚降解率也達到了47.0%以上;48 h時,四株乳酸桿菌棉酚降解率均在50%以上,均優(yōu)于乳酸菌單獨發(fā)酵時的棉酚降解率(見表2)?;罹鷶?shù)在109CFU/g水平,以菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092發(fā)酵的活菌數(shù)較高。pH值方面,菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092較低,發(fā)酵24 h時pH值分別為4.62和4.71,顯著低于其他兩株(P<0.05)。

        表4 乳酸桿菌加中性蛋白酶發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響Table 4 Effect ofLactobacillusspp.with neutral protease on fermented feed quality

        綜上所述,添加中性蛋白酶的乳酸桿菌發(fā)酵可有效降解棉粕中棉酚含量,菌株BLCC2-0092添加1000U/g的中性蛋白酶發(fā)酵24 h時棉酚降解率為67.13%,pH值為4.71,效果最優(yōu)。

        3 結(jié)論

        本實驗旨在利用芽孢桿菌和乳酸桿菌發(fā)酵棉粕,研究對棉粕中游離棉酚降解率及飼料品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn):芽孢桿菌發(fā)酵棉粕降解棉酚效果與菌株產(chǎn)中性蛋白酶的高低有關(guān),棉酚降解率最優(yōu)的芽孢桿菌為BLCC1-0039,37℃發(fā)酵24 h時,棉酚降解率已達到85.89%,產(chǎn)中性蛋白酶活性達到2 811.00 U/g發(fā)酵料;發(fā)酵48 h時,產(chǎn)中性蛋白酶活為2 303.24 U/g,棉酚降解率達91.47%,與其他菌株差異顯著(P<0.05)。芽孢桿菌發(fā)酵棉粕可產(chǎn)生降解棉酚的物質(zhì),其中中性蛋白酶起著重要作用:單獨添加中性蛋白酶發(fā)酵24 h時,1 000 U/g的添加量棉酚降解率已達到58.46%,2 000 U/g的添加量時棉酚降解率達到72.68%;48 h時,1000U/g中性蛋白酶添加量的棉酚降解率最高為73.29%。乳酸桿菌無降解棉酚的能力,但乳酸桿菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶發(fā)酵24 h時,棉酚降解率達到67.13%,pH值降至4.71。

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        Degradation of cottonseed meal gossypol by neutral protease

        QI Xiuye,XIE Quanxi,CHEN Zhen,YU Jiamin,ZENG Jiajia,XU Haiyan,GU Wei
        (Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

        UsingBacillusandLactobacillusto ferment cottonseed meal,the effects of strains on the degradation rate of free gossypol and feed quality was studied.Results indicated that withBacillusBLCC1-0039 cultured at 37℃for 24 h,the degradation rate of gossypol was 85.89%(P<0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 811.40 U/g(P<0.05).With fermentation for 48 h,the degradation rate of gossypol was 91.47%(P<0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 303.24 U/g.With the addition of 1 000 U/g neutral protease individually for 24 h fermentation,the degradation rate of gossypol was 58.46%,however,with the addition of 2 000 U/g neutral protease individually,the degradation rate of gossypol reached 72.68%.With the addition of 1 000 U/g neutral protease for 48 h fermentation,the degradation rate of gossypol reached 73.29%.Lactobacillus sp.can not degrade gossypol,but after the strain BLCC2-0092 fermentation with 1 000 U/g neutral protease for 24 h,the gossypol degradation rate reached 67.13%,pH value decreased to 4.71.

        neutral protease;gossypol;cottonseed meal;Bacillus;Lactobacillus

        TQ920.6

        0254-5071(2017)10-0144-05

        10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.030

        2017-05-04

        泰安市科技發(fā)展計劃(201540701)

        亓秀曄(1987-),女,助理研究員,碩士,主要從事動物微生態(tài)制劑研發(fā)工作。

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