張歡，唐輝，劉艷芳，吳旭東，陳歡

（石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

棉酚（Gossypo1）又稱棉籽醇，是天然存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉莖以及根部等器官中的一種黃色多元酚類化合物，本身為消旋體，其分子中兩個(gè)萘環(huán)之間存在阻轉(zhuǎn)異構(gòu)現(xiàn)象，具有手性軸，有左、右旋體［1］。棉酚具有抗腫瘤、抗病毒和抗菌等作用［2－4］。現(xiàn)有的研究已表明棉酚的藥理作用與其分子手性結(jié)構(gòu)相關(guān)，（－）－棉酚的活性比（＋）－棉酚強(qiáng)，（－）－棉酚是（±）－棉酚的主要藥用活性成分，其對(duì)細(xì)胞的敏感性及對(duì)細(xì)胞的殺傷作用是（±）－棉酚的5倍多［5］，且毒副反應(yīng)?。?］。棉酚分子中的酚羥基極易氧化而降低其藥用活性，故常將棉酚與冰醋酸絡(luò)合形成更穩(wěn)定、更利于保存和運(yùn)輸?shù)拇姿崦薹优浜衔?，目前已上市的棉酚制劑亦多為醋酸棉酚片劑?/p>

關(guān)于棉酚及其衍生物穩(wěn)定性的研究較少［7］，本課題組已報(bào)道［8］棉酚原料藥的穩(wěn)定性，本文旨在考察熱、濕、光對(duì)高活性的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚原料藥穩(wěn)定性的影響，為該藥原料標(biāo)準(zhǔn)制定新制劑的研究奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器

美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀；德國(guó)SartoriusBP211D電子天平；北京泰克X－5型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀；寧波東南RXZ－300C型智能人工氣候箱；法國(guó)MOS 450圓二色譜儀；美國(guó)Autopol V旋光儀。

1．1．2 試藥

棉酚對(duì)照品（美國(guó)SIGMA公司，含量95%，Lot 20k4057）；（－）－棉酚樣品3批（自制）；（－）－醋酸棉酚樣品3批（自制）；（＋）－棉酚樣品（自制）；（＋）－醋酸棉酚樣品（自制）；磷酸、甲醇、氯仿（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水為重蒸水。

1．2 方法

1．2．1 熔點(diǎn)測(cè)定

取（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品適量，以 X－5型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（使用前已校正）測(cè)定，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1．2．2 比旋度測(cè)定

精密 稱 取 （－）－棉 酚 及 （－）－醋 酸 棉 酚 樣 品 各 9 mg，置于10mL容量瓶中，以重蒸氯仿溶解并定容，搖勻，以旋光儀測(cè)定。

1．2．3 旋光特性

精密稱取（－）－棉酚、（－）－醋酸棉酚、（＋）－棉酚及（＋）－醋酸棉酚樣品各2mg，置于25mL容量瓶中，以重蒸氯仿溶解并定容，搖勻，以圓二色譜儀測(cè)定。

1．2．4 色譜條件

色譜柱為 Wondasil C18Column（4．6mm×150 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇：0．7%磷酸水＝85∶15，流速1．0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)238nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。

1．2．5 色譜條件的方法學(xué)考察

1．2．5．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取棉酚對(duì)照品12．50mg，置于50mL容量瓶中，甲醇溶解定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別精密移取對(duì)照品溶液1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0 mL置于25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，成為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。各取20μL，注入 HPLC儀，記錄色譜圖。

1．2．5．2 精密度及回收率試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為30μg／mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算精密度。精密稱取已知含量的（－）－棉酚樣品（批號(hào)：100123），分別加入相對(duì)于樣品含量80%、100%、120%3種不同比例的對(duì)照品及甲醇。平行操作3次，計(jì)算加樣回收率。

1．2．5．3 樣品含量測(cè)定

精密 稱 取 （－）－棉 酚 及 （－）－醋 酸 棉 酚 樣 品 各 5 mg，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解定容，移取0．6 mL置于10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，成為樣品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1．2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1．2．6．1 高溫試驗(yàn)

取精密稱重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品，置已知質(zhì)量的稱量瓶中（去蓋），鋪成5mm厚的薄層，置人工氣候箱內(nèi)，于40℃恒溫條件下放置10d，分別在第5天、第10天取樣考察。

1．2．6．2 高濕試驗(yàn)

取精密稱重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品，置已知質(zhì)量的稱量瓶中（去蓋），鋪成5mm厚的薄層，置人工氣候箱內(nèi)，于相對(duì)濕度75%、溫度25℃條件下放置10d，分別在第5天、第10天取樣考察。

1．2．6．3 強(qiáng)光照試驗(yàn)

取精密稱重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品，置已知質(zhì)量的稱量瓶中（去蓋），鋪成5mm厚的薄層，置人工氣候箱內(nèi)，于光照照度4500Lx±500Lx條件下放置10d，分別在第5天、第10天取樣考察。

1．2．6．4 長(zhǎng)期試驗(yàn)

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，真空封裝于錫箔包裝紙內(nèi)，置人工氣候干燥箱內(nèi)，于溫度40℃，相對(duì)濕度RH75%條件下放置6個(gè)月，每個(gè)月取樣測(cè)定。

1．2．6．5 加速試驗(yàn)

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，真空封裝于錫箔包裝紙內(nèi)，置人工氣候干燥箱內(nèi)，于溫度25℃，相對(duì)濕度RH60%條件下放置6個(gè)月，每個(gè)月取樣測(cè)定。

1．2．6．6 留樣考察

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，真空封裝于錫箔包裝紙內(nèi)，置于冰箱中（5℃）冷藏放置6個(gè)月，每個(gè)月取樣測(cè)定。

2 結(jié)果

2．1 理化性質(zhì)

2．1．1 性狀

（－）－棉酚為黃色粉末，（－）－醋酸棉酚為棕黃色粉末。

2．1．2 熔點(diǎn)

（－）－棉酚的熔點(diǎn)為180．0～182 ℃，（－）－醋酸棉酚的熔點(diǎn)為176．5～178．2℃。

2．1．3 旋光度

（－）－棉酚的比旋度［α］20D＝－353，（－）－醋酸棉酚的比旋度［α］20D＝－80．3。（－）－棉酚的比旋度值與文獻(xiàn)報(bào)道（［α］15D＝－354．2）相近［8］，（－）－醋酸棉酚的比旋度值未見報(bào)道。

2．1．4 旋光特性

圓二色譜圖見圖1、圖2。由圖可知（－）－棉酚與（＋）－棉酚、（－）－醋酸棉酚與（＋）－醋酸棉酚的圓二色譜圖均呈鏡像關(guān)系，對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處的Cotton效應(yīng)相 反，說明兩兩互為對(duì)映異構(gòu)體。

圖1 （＋）－棉酚和（－）－棉酚 CD圖譜Fig．1CD chromatogram of（＋）－gossypol and（－）－gossypol

圖2 （＋）－醋酸棉酚和（－）－醋酸棉酚 CD圖譜Fig．2CD chromatogram of（＋）－gossypol acetic acid and（－）－gossypol acetic acid

2．2 含量測(cè)定

2．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

其液相色譜圖見圖3。

圖3 棉酚HPLC色譜圖Fig．3HPLC chromatogram of gossypol

以對(duì)照品濃度作為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝149．71x－422．3，R2＝0．9992，結(jié)果表明（－）－棉酚質(zhì)量濃度為10～60μg／mL時(shí)線性關(guān)系良好，棉酚的保留時(shí)間約為8．2min。

2．2．2 精密度及回收率結(jié)果

精密度RSD＝0．1%（n＝5）；平均回收率為99．55%，RSD 為0．79%。

2．3 穩(wěn)定性［9－10］

2．3．1 高溫試驗(yàn)

第5天、第10天時(shí)樣品性狀無變化且未發(fā)生消旋化，含量、熔點(diǎn)及比旋度變化見表1?？梢姌悠穼?duì)高溫不穩(wěn)定。

表1 高溫試驗(yàn)n＝3Tab．1The experiment of high temperature condition

2．3．2 高濕試驗(yàn)

第5天、第10天時(shí)樣品性狀無變化且未發(fā)生消旋化，含量、熔點(diǎn)及比旋度變化見表2?？梢姌悠穼?duì)高濕不穩(wěn)定。

表2 高濕試驗(yàn)n＝3Tab．1The experiment of high wet condition

2．3．3 強(qiáng)光照射試驗(yàn)

第5天、第10天時(shí)樣品性狀無變化且未發(fā)生消旋化，含量、熔點(diǎn)及比旋度變化見表3。可見樣品對(duì)強(qiáng)光不穩(wěn)定。

表3 強(qiáng)光照射試驗(yàn)n＝3Tab．3The experiment of highlight condition

2．3．4 加速試驗(yàn)

樣品的外觀性狀無變化且未發(fā)生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分別下降了7．87%和3．76%，說明樣品對(duì)濕熱相對(duì)不穩(wěn)定。

2．3．5 長(zhǎng)期試驗(yàn)

樣品的外觀性狀無變化且未發(fā)生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分別下降了4．15%和1．87%，說明樣品對(duì)濕熱相對(duì)不穩(wěn)定。

2．3．6 留樣考察

樣品的外觀性狀無變化且未發(fā)生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分別下降了1．47%和0．43%，說明樣品在該條件下相對(duì)穩(wěn)定，且（－）－醋酸棉酚比（－）－棉酚穩(wěn)定。

3 討論

以 HPLC法定量時(shí)，（±）－棉酚、（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚的出峰時(shí)間一致，故以（±）－棉酚作對(duì)照品測(cè)含量。（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚為本實(shí)驗(yàn)室自制，薄層顯示為一個(gè)斑點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜MS和核磁共振NMR的結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［11］一致。

本試驗(yàn)以棉酚穩(wěn)定性研究的報(bào)道為基礎(chǔ)，考察了（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚原料藥的穩(wěn)定性，選用了專屬性更強(qiáng)，靈敏度更高的HPLC法檢測(cè)其含量變化，結(jié)果更準(zhǔn)確。

由穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可看出，樣品在高溫、高濕、強(qiáng)光照射條件下均不穩(wěn)定，含量明顯下降；在長(zhǎng)期、加速試驗(yàn)條件下含量下降較少；在避光冷藏條件下相對(duì)穩(wěn)定，故在生產(chǎn)應(yīng)用中樣品應(yīng)置于避光、陰涼、干燥處保存。

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