張夢(mèng)園，董 爍，李 婧，李 輝，張軍翔*

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，寧夏 銀川 750021）

菠蘿蛋白酶對(duì)干白葡萄酒蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

張夢(mèng)園1，董 爍2，李 婧3，李 輝1，張軍翔2*

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，寧夏 銀川 750021）

研究菠蘿蛋白酶對(duì)干白葡萄酒蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，以新鮮干白葡萄酒為試驗(yàn)材料，添加菠蘿蛋白酶，通過測(cè)定葡萄酒的濁度、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)含量，確定其最適添加量、作用溫度和作用時(shí)間。結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶對(duì)兩款酒樣澄清的最佳添加量分別為2.0 mg/L、2.5 mg/L，溫度均為22℃，作用時(shí)間為24 h。菠蘿蛋白酶可澄清干白葡萄酒，明顯提高其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；菠蘿蛋白酶；澄清

干白葡萄酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性對(duì)酒的品質(zhì)具有重要作用。幼年白葡萄酒裝瓶后，在一定貯藏條件下，瓶中的蛋白質(zhì)粒子或其反應(yīng)物逐漸聚集，可能使葡萄酒變得渾濁不清，產(chǎn)生沉淀，嚴(yán)重影響葡萄酒的感官質(zhì)量。因此，研究葡萄酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免白葡萄酒在貯藏過程中出現(xiàn)蛋白渾濁現(xiàn)象，具有重要的實(shí)際意義。葡萄酒的渾濁程度由濁度反映，濁度越大渾濁程度越高。葡萄酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性由熱檢驗(yàn)前后葡萄酒的濁度差表示，與形成蛋白質(zhì)渾濁的可能性成正比。一般認(rèn)為，濁度差不超過2 NTU（濁度單位）即可判定該葡萄酒蛋白質(zhì)穩(wěn)定[1]。

近些年使用蛋白質(zhì)水解酶代替皂土處理葡萄酒防止蛋白質(zhì)破敗，已經(jīng)引起研究人員和釀酒師們的重視。蛋白質(zhì)是由氨基酸通過肽鍵連接起來的一種多肽大分子，可以找出一種或幾種非專一酶切位點(diǎn)的酶對(duì)葡萄酒中的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，將酒中的蛋白質(zhì)分子切成小肽片段或氨基酸，這樣在防止酒中蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性的同時(shí)，既不顯著影響葡萄酒的感官品質(zhì)，又能增加酒中多肽和氨基酸的含量，提高酒的營養(yǎng)價(jià)值[2]。

從植物中提取的蛋白酶類由于具有一定的澄清效果，被逐漸應(yīng)用于飲料、果酒、啤酒的澄清。郭玉蓉[3]研究表明，木瓜蛋白酶對(duì)梅鹿輒干紅葡萄酒的澄清效果好，用量少、脫色輕；陳彥雄等[4]研究認(rèn)為木瓜蛋白酶是較理想的赤霞珠葡萄酒澄清劑。張傳軍[5]研究發(fā)現(xiàn)，0.6%的木瓜蛋白酶在45℃反應(yīng)38h后，可有效減少白葡萄酒中非穩(wěn)定蛋白含量。柴麗娟等[6]向紅葡萄酒中添加生姜蛋白酶，研究結(jié)果顯示其對(duì)紅葡萄酒的澄清效果顯著。菠蘿蛋白酶是存在于菠蘿莖和果實(shí)中的一類蛋白水解酶，屬于半胱氨酸蛋白酶，已經(jīng)應(yīng)用于白葡萄酒中預(yù)防酒體渾濁[7]。菠蘿蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性較木瓜蛋白酶高10倍以上，具有很強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)能力，并且具有酯鍵和酰胺鍵特性，已被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥和食品行業(yè)[8]。徐鳳彩等[9]用菠蘿蛋白酶處理啤酒后，處理組比對(duì)照組啤酒的渾濁度下降了1.51～5.3倍，蛋白質(zhì)含量下降了73%，而啤酒的口感、酒精含量、色度、總酸等指標(biāo)無明顯變化。BENUCCI I等[10]最新研究顯示固定化菠蘿蛋白酶在減少沉淀形成和總蛋白質(zhì)含量的影響上，比固定化木瓜蛋白酶更顯著，同時(shí)對(duì)葡萄酒的酚類物質(zhì)，礦物成分及感官品質(zhì)影響不明顯。目前，國內(nèi)關(guān)于菠蘿蛋白酶澄清干白葡萄酒及其對(duì)干白葡萄酒中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響的研究還鮮見報(bào)道。

為了更好地解決白葡萄酒貯藏過程中出現(xiàn)蛋白沉淀的現(xiàn)象，又同時(shí)保留酒的香氣、風(fēng)味，本試驗(yàn)利用菠蘿蛋白酶水解賀蘭山東麓霞多麗、貴人香干白葡萄酒中的不穩(wěn)定蛋白，通過測(cè)定干白葡萄酒的濁度、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、葡萄酒中的蛋白質(zhì)總量，研究菠蘿蛋白酶的最佳用量和作用溫度、作用時(shí)間，觀察菠蘿蛋白酶對(duì)干白葡萄酒的澄清效果，及其對(duì)干白葡萄酒中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。以期為干白葡萄酒的澄清提供新的方法，為菠蘿蛋白酶應(yīng)用于提高干白葡萄酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2016年10月未澄清的霞多麗干白葡萄酒（A）：寧夏類人首葡萄酒業(yè)有限公司；2016年10月未澄清的貴人香干白葡萄酒（B）：寧夏西夏王葡萄酒業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

菠蘿蛋白酶（酶活600 U/mg）：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、磷酸、乙醇（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2.0 mg/mL）：美國Pierce公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2100Q濁度計(jì)：美國哈希公司；TU-1901紫外可分光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9070A恒溫干燥箱：上海右一儀器有限公司；FA1004萬分之一天平：上海上天精密儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿蛋白酶最適添加量、最適作用溫度、作用時(shí)間的

確定

取40mL干白葡萄酒樣于棕色玻璃密封瓶中，分別用菠蘿蛋白酶在一定溫度條件下作用一定時(shí)間后用0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾[11]。每個(gè)處理重復(fù)三次。分別考察不同菠蘿蛋白酶添加量（0、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L、3.5mg/L）、不同作用溫度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃）、不同作用時(shí)間（12 h、24 h、48 h、72 h、96h）對(duì)干白葡萄酒濁度、蛋白質(zhì)總量和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。

1.3.2 測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支試管分別配制0、10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的牛血清白蛋白溶液各2 mL，從各試管中分別取1 mL溶液于具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)R-250溶液混合均勻，待反應(yīng)20 min后，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)其吸光度值。以吸光度值（x）為橫坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量（y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=246.37x-3.645 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 2。

樣品中蛋白質(zhì)總量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色法[12]，取1 mL過濾后的酒樣，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)R-250溶液，以用1 mL蒸餾水作空白，待反應(yīng)20 min后，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)其吸光度值，根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酒樣中蛋白質(zhì)總量。

濁度：采用濁度儀測(cè)定[13]，以干白葡萄酒的濁度值表示酒樣的澄清度，濁度值越小澄清度越好。

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性：將菠蘿蛋白酶水解且過濾的酒液用濁度儀測(cè)定其濁度值，以NTU（散射濁度單位）表示，記為α。將酒液放入80℃恒溫水浴鍋中加熱6 h后，于4℃保持16 h，最后冷卻至室溫，再用濁度儀測(cè)定其測(cè)濁度，記為β[14]。計(jì)算加熱處理前后的濁度差（濁度差=β-α），濁度差不超過2NTU則可判定葡萄酒蛋白質(zhì)穩(wěn)定，反之不穩(wěn)定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿蛋白酶添加量的確定

2.1.1 菠蘿蛋白酶添加量對(duì)干白葡萄酒濁度及蛋白質(zhì)穩(wěn)定

性的影響

考察菠蘿蛋白酶添加量對(duì)干白葡萄酒濁度和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 菠蘿蛋白酶添加量對(duì)葡萄酒濁度（a）和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性（b）的影響Fig.1 Effect of bromelain addition on wine turbidity(a)and protein stability(b)

由圖1可知，隨著菠蘿蛋白酶添加量的增加，葡萄酒的濁度和澄清度均呈先降低后增加的趨勢(shì)，其中A款葡萄酒在添加2.0 mg/L的菠蘿蛋白酶時(shí)濁度最?。?.73 NTU），澄清度良好，熱處理濁度差最小（1.43 NTU），表明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性良好；隨后菠蘿蛋白酶添加量增加，葡萄酒的濁度上升，濁度差變大；B款葡萄酒在菠蘿蛋白酶添加量2.5 mg/L時(shí)濁度達(dá)到最小，蛋白質(zhì)最穩(wěn)定。添加菠蘿蛋白酶對(duì)葡萄酒中不穩(wěn)定蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，可提高葡萄酒的澄清度和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，但當(dāng)葡萄酒中的菠蘿蛋白酶超過最適添加量之后，由于其本身屬于一種蛋白質(zhì)，過多的菠蘿蛋白酶反而不利于葡萄酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。因此，A款和B款葡萄酒的菠蘿蛋白酶最適添加量分別為2.0 mg/L和2.5 mg/L。

2.1.2 菠蘿蛋白酶添加量對(duì)干白葡萄酒中蛋白質(zhì)總量的影響

考察菠蘿蛋白酶添加量對(duì)干白葡萄酒中蛋白質(zhì)總量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 菠蘿蛋白酶添加量對(duì)干白葡萄酒中蛋白質(zhì)總量的影響Fig.2 Effect of bromelain addition on total protein content in dry white wine

由圖2可知，隨著菠蘿蛋白酶用量的增加，兩款葡萄酒中的蛋白質(zhì)總量均呈先降低后增加的趨勢(shì)，其中A款葡萄酒添加2.0 mg/L菠蘿蛋白酶時(shí)，蛋白質(zhì)總量下降到最?。?5.04 mg/L）；B款葡萄酒添加2.5 mg/L菠蘿蛋白酶時(shí)，蛋白質(zhì)總量最?。?4.30 mg/L）。繼續(xù)增加菠蘿蛋白酶添加量，兩款葡萄酒的蛋白質(zhì)總量均開始上升，這與喬園園[17]的研究結(jié)果相似，高酶濃度處理過的酒樣會(huì)受蛋白酶的影響，蛋白質(zhì)含量增多，不利于葡萄酒優(yōu)良品質(zhì)的形成。結(jié)果表明，A款和B款葡萄酒的菠蘿蛋白酶最適添加量分別為2.0mg/L和2.5 mg/L。

2.2 菠蘿蛋白酶作用溫度的確定

考察菠蘿蛋白酶作用溫度對(duì)干白葡萄酒蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著作用溫度的升高，兩款酒樣的濁度差均先下降后趨于平緩。經(jīng)菠蘿蛋白酶作用后兩款葡萄酒熱處理后濁度差均＜2 NTU，表明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較好；當(dāng)作用溫度為22℃時(shí)，A、B兩款葡萄酒的濁度差最小，分別為1.54 NTU和1.18 NTU，此時(shí)葡萄酒的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性最好。溫度對(duì)植物蛋白酶的活性影響很大，BENUCCI I等[16]研究結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶在10～60℃均有活性，但因生產(chǎn)中溫度過高會(huì)影響葡萄酒的香氣和品質(zhì)，也會(huì)增加蛋白質(zhì)渾濁產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。由圖3可知，選擇22℃為菠蘿蛋白酶的最適作用溫度。

圖3 菠蘿蛋白酶的作用溫度對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of bromelain action temperature on protein stability

考察菠蘿蛋白酶作用溫度對(duì)干白葡萄酒蛋白質(zhì)總量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 菠蘿蛋白酶作用溫度對(duì)葡萄酒中蛋白質(zhì)總量的影響Fig.4 Effect of bromelain action temperature on total protein content

由圖4可知，隨著作用溫度在18～26℃范圍內(nèi)增加，A、B兩款酒的蛋白質(zhì)總量先降低后趨于平緩。當(dāng)作用溫度為22℃時(shí)，蛋白質(zhì)總量最低，菠蘿蛋白酶的作用效果最好，水解酒樣中的蛋白質(zhì)最多，生產(chǎn)中溫度過高會(huì)增加葡萄酒產(chǎn)生渾濁的風(fēng)險(xiǎn)，也會(huì)損耗酒的香氣，所以參考實(shí)際試驗(yàn)，選擇22℃為菠蘿蛋白酶的最適作用溫度。

2.3 菠蘿蛋白酶作用時(shí)間的確定

考察菠蘿蛋白酶作用時(shí)間對(duì)干白葡萄酒蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著菠蘿蛋白酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄酒的濁度差先下降后趨于平緩。當(dāng)作用時(shí)間為12 h時(shí)，A、B兩款酒的濁度差均＞2 NTU，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，當(dāng)作用時(shí)間≥24 h，葡萄酒的濁度差均＜2 NTU，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)變化不明顯，表明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性良好，因此24 h可作為菠蘿蛋白酶的最佳作用時(shí)間。

圖5 菠蘿蛋白酶作用時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of bromelain action time on protein stability

考察菠蘿蛋白酶作用時(shí)間對(duì)干白葡萄酒蛋白質(zhì)總量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 菠蘿蛋白酶的作用時(shí)間對(duì)葡萄酒蛋白質(zhì)總量的影響Fig.6 Effect of bromelain action time on total protein content

由圖6可知，隨著菠蘿蛋白酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄酒的蛋白質(zhì)總量先下降后趨于平緩。A、B兩款葡萄酒經(jīng)菠蘿蛋白酶作用12 h，酒樣中的蛋白質(zhì)總量最高，為19.02 mg/L；當(dāng)作用時(shí)間為24h，酒樣中的蛋白質(zhì)總量減小，為12.12mg/L；繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間，A、B兩款葡萄酒中蛋白質(zhì)總量沒有明顯變化，趨于穩(wěn)定。在酒樣相同（即底物濃度一定）且菠蘿蛋白酶添加量一定，作用溫度相同的情況下，蛋白酶保持活性將酒中的不穩(wěn)定蛋白水解為小肽片段、氨基酸；水解酶作用結(jié)束，失去活性，酒樣中蛋白質(zhì)總量減小且隨時(shí)間變化不再明顯變化。從經(jīng)濟(jì)效益及操作效率方面考慮，菠蘿蛋白酶對(duì)白葡萄酒中的蛋白質(zhì)水解的最佳作用時(shí)間為24 h。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用菠蘿蛋白酶澄清干白葡萄酒，研究了其對(duì)白葡萄酒濁度及蛋白質(zhì)總量的影響。結(jié)果表明，A、B兩款葡萄酒的菠蘿蛋白酶最適添加量分別為2.0 mg/L和2.5 mg/L，22℃作用24 h時(shí)，菠蘿蛋白酶對(duì)干白葡萄酒的澄清效果較好，且蛋白質(zhì)穩(wěn)定性良好。目前，葡萄酒廠為提高干白葡萄酒的澄清度和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，主要選擇皂土作為澄清劑，而皂土所存在的諸多弊端使尋找新的可替代澄清材料成為白葡萄酒生產(chǎn)的迫切需求，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶可澄清干白葡萄酒，提高其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，有望在今后應(yīng)用于廣泛的生產(chǎn)中，具有一定實(shí)際意義。

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Effect of bromelain on protein stability of dry white wine

ZHANG Mengyuan1,DONG Shuo2,LI Jing3,LI Hui1,ZHANG Junxiang2*
(1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2.Wine School,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;3.Technology Center of Ningxia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Yinchuan 750021,China)

The effect of bromelain on protein stability of dry white wine was researched.Using the fresh dry white wine as experimental material,with addition of bromelain,the optimum bromelain addition,action temperature and time were determined by the determination of wine turbidity,protein stability and protein content.The results showed that the optimum bromelain addition to clarify two wine samples were 2.0 mg/L and 2.5 mg/L,respectively.The action temperature and time were 22℃and 24 h,respectively.The bromelain could clarify dry white wine and improve protein stability significantly.

protein stability;bromelain;clarification

TS262.6

0254-5071（2017）10-0052-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.012

2017-05-23

寧夏重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重大項(xiàng)目（2016BZ06）

張夢(mèng)園（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸丫频姆€(wěn)定性。

*通訊作者：張軍翔（1971-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒釀造。